段佳麗，薛泉宏,*，舒志明，王東勝，何 斐

1 西北農(nóng)林科技大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院, 楊凌 712100 2 西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 楊凌 712100

放線菌Act12與腐植酸鉀配施對(duì)丹參生長(zhǎng)及其根域微生態(tài)的影響

段佳麗1，薛泉宏1,*，舒志明2，王東勝1，何 斐2

1 西北農(nóng)林科技大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院, 楊凌 712100 2 西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 楊凌 712100

探討生防放線菌菌劑與腐植酸鉀配施對(duì)丹參生長(zhǎng)及其根域微生態(tài)的影響。以常規(guī)移栽處理為對(duì)照，研究小區(qū)試驗(yàn)中放線菌菌劑與腐植酸鉀不同配施比例下對(duì)丹參生長(zhǎng)、產(chǎn)量及抗根結(jié)線蟲侵染的影響；并采用稀釋平皿涂抹法測(cè)定丹參根區(qū)土壤、根表土壤、根外土壤及根系中細(xì)菌(B)、真菌(F)與放線菌(A)的數(shù)量，同時(shí)對(duì)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌、真菌和放線菌進(jìn)行了分子生物學(xué)鑒定，研究放線菌菌劑與腐植酸鉀配施處理下丹參根域微生態(tài)變化。研究結(jié)果表明:①配施能增強(qiáng)菌劑對(duì)丹參的促生效果。菌劑與腐植酸鉀配施T20處理丹參出苗率較對(duì)照提高8.7%，收獲時(shí)的死亡率較對(duì)照減少39.0%；莖葉鮮質(zhì)量、根鮮質(zhì)量、單株根鮮質(zhì)量、根干質(zhì)量以及單株根干質(zhì)量分別較對(duì)照增加6.1%、28.6%、11.1%、36.3%以及9.0%。②可以調(diào)整丹參植株根域土壤微生態(tài)平衡，降低有害微生物數(shù)量，增加有益微生物數(shù)量，改善微生物區(qū)系。在丹參根表土壤中，菌劑與腐植酸鉀配施處理B/A值較對(duì)照降低78.4%，A/F值較對(duì)照增加95.0%。在丹參根系內(nèi)，菌劑與腐植酸鉀配施處理細(xì)菌數(shù)量較對(duì)照增加195.0%，未檢測(cè)到真菌和放線菌存在。③在放線菌處理丹參根區(qū)、根表土壤中，有6株優(yōu)勢(shì)菌可能對(duì)丹參生長(zhǎng)及抗病有益：3株優(yōu)勢(shì)細(xì)菌分別為硝基愈瘡木膠節(jié)桿菌(Arthrobacternitroguajacolicus)、放射型根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)和弗雷德里克斯堡假單胞菌(Pseudomonasfrederiksbergensis)；3株優(yōu)勢(shì)放線菌分別為淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomycesdiastatochromogenes)、磚紅鏈霉菌(S.lateritius)和卡伍爾鏈霉菌(S.cavourensis)。有2株優(yōu)勢(shì)菌疑為有害微生物：優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為耐寒短桿菌(Brevibacteriumfrigoritolerans)，優(yōu)勢(shì)放線菌為腫痂鏈霉菌(S.turgidiscabies)。這2種菌對(duì)其他作物的有害作用已有報(bào)道。④對(duì)丹參根結(jié)線蟲侵染有強(qiáng)烈抑制作用，可使田間根結(jié)線蟲侵染率降低49.3%。生防放線菌與腐植酸鉀配施處理后能明顯促進(jìn)丹參生長(zhǎng)，提高丹參產(chǎn)量及抗病蟲能力，調(diào)節(jié)丹參根域微生態(tài)平衡。

丹參；放線菌劑；腐植酸鉀；土壤微生物區(qū)系；優(yōu)勢(shì)微生物

丹參(SalviamiltiorrhizaBge.)是唇形科鼠尾草屬的多年生草本植物，以根入藥，是我國(guó)常用的中草藥，具有活血化瘀、調(diào)經(jīng)止痛、養(yǎng)血安神等功效[1]。由于丹參需求量增加而引起的人工栽培規(guī)模擴(kuò)大化，促使丹參連作障礙愈加嚴(yán)重。丹參為根用藥材，其特性決定不能大量施用化學(xué)農(nóng)藥防治丹參的根系病害，因此微生物制劑對(duì)丹參連作障礙修復(fù)有重要意義。本研究使用的多功能放線菌Act12菌劑對(duì)植物生長(zhǎng)有刺激作用并能提高作物的誘導(dǎo)抗性，同時(shí)通過對(duì)根域土壤微生物區(qū)系的調(diào)節(jié)作用抑制有害微生物生長(zhǎng)，促進(jìn)有益菌生長(zhǎng)繁殖，實(shí)現(xiàn)菌劑的防病促生效果。已有研究表明，放線菌Act12菌劑接種能顯著增加黃瓜、甜瓜生物量，促進(jìn)其生長(zhǎng)發(fā)育并產(chǎn)生誘導(dǎo)抗性[2-3]。利用生防放線菌菌劑Act12蘸根接種可以促進(jìn)丹參生長(zhǎng)及有效成分含量的提高，并且對(duì)根結(jié)線蟲侵染有強(qiáng)烈的抑制作用[4]。

但是，目前研究肥料與放線菌劑混合施用對(duì)植物的防病促生作用的報(bào)道很少。有研究指出，向土壤中施入有機(jī)養(yǎng)分或有機(jī)與無(wú)機(jī)混合養(yǎng)分，可顯著促進(jìn)接入生防放線菌在土壤中生長(zhǎng)繁殖，提高生防放線菌的防病促生效果[5]。趙娟發(fā)現(xiàn)在施用復(fù)合肥和有機(jī)肥條件下，放線菌Act12菌劑能顯著促進(jìn)甜瓜生長(zhǎng)，增加產(chǎn)量，提高品質(zhì)，并增強(qiáng)甜瓜的抗病抗逆能力；改善甜瓜根際微生態(tài)環(huán)境達(dá)到微生態(tài)平衡，降低發(fā)生病害的風(fēng)險(xiǎn)[6]。申光輝等研究發(fā)現(xiàn)，硅肥與放線菌劑配施可以降低草莓死亡率，增加草莓生物量，提高果實(shí)品質(zhì)，并能有效降低草莓根腐病的發(fā)生率[7]。肥料本身對(duì)作物生長(zhǎng)就有良好的促進(jìn)作用，菌劑與適合的肥料配合使用時(shí)對(duì)菌劑中的有益活菌繁殖有促進(jìn)效應(yīng)，對(duì)菌劑有增效作用；同時(shí)，菌劑對(duì)作物根系的刺激作用促進(jìn)了肥料效應(yīng)的發(fā)揮。放線菌是土壤微生物中數(shù)量?jī)H次于細(xì)菌的三大微生物類群之一，主要依賴土壤中的有機(jī)物質(zhì)生長(zhǎng)繁殖。土壤有機(jī)物質(zhì)中的腐植酸是放線菌生長(zhǎng)所需的碳源及能源物質(zhì)之一。在接種放線菌制劑的同時(shí)配合使用腐植酸物質(zhì)，有利于放線菌生長(zhǎng)繁殖，提高菌劑的作用效果；加之腐植酸本身對(duì)植物就有良好的促生作用。二者結(jié)合，具有相互的增效作用。本研究進(jìn)行了放線菌菌劑與腐植酸鉀的配施試驗(yàn)，旨在探索二者配施時(shí)對(duì)丹參的促生效果及微生態(tài)機(jī)制，為放線菌菌劑在丹參上的高效施用技術(shù)確立提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

丹參品種：商洛丹參，由陜西天士力植物藥業(yè)有限公司藥源基地提供。

放線菌劑：利用放線菌Act12通過固態(tài)發(fā)酵制備，菌劑活菌數(shù)為2.0×109cfu/g。該菌是微生物資源研究室從分離自青藏高原、黃土高原土壤的萬(wàn)余株放線菌中篩選到的1株多功能放線菌，經(jīng)16S rDNA序列分析鑒定為密旋鏈霉菌(Streptomycespactum)，該菌具有良好的抑菌抗病解毒及促生作用[8]。

腐植酸鉀：水溶性腐植酸含量大于400.0g/kg，K2O含量≥50.0g/kg，由新疆雙龍腐植酸有限公司生產(chǎn)。

培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨瓊脂(BPA)、馬鈴薯蔗糖瓊脂(PDA)、高氏1號(hào)(GA)[9]。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)地點(diǎn)為陜西楊凌現(xiàn)代農(nóng)業(yè)示范園中藥基地。

試驗(yàn)設(shè)5個(gè)處理：CK為對(duì)照，常規(guī)移栽；T0為腐植酸鉀蘸根；T10為放線菌劑Act12與腐植酸鉀(1∶9)配施蘸根；T20為放線菌劑Act12與腐植酸鉀(1∶19)配施蘸根；T50為放線菌劑Act12與腐植酸鉀(1∶49)配施蘸根。底肥為N、P、K復(fù)合肥，50 kg/667 m2。試驗(yàn)采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，每個(gè)處理重復(fù)3小區(qū)，小區(qū)面積20 m2，每區(qū)栽種12行，每行13株，行距30 cm，共156株。

菌劑+腐植酸鉀配施：丹參移栽時(shí)用不同比例混合的腐植酸鉀-生防菌混合菌粉蘸根并穴施。具體方法是，將大小一致的丹參幼苗根系用水浸濕，蘸根接種菌粉后移栽(保證丹參根系表面均勻粘上菌粉)，此外每穴再施入5 g混合菌粉。移栽時(shí)盡量將幼苗的蘆頭(發(fā)根部位)用土掩蓋并壓實(shí)。

1.2.2 丹參出苗率調(diào)查及丹參生物量統(tǒng)計(jì)

2010-04-01移栽，2010-06-01調(diào)查丹參出苗率。2010-11-30收獲時(shí)，將每個(gè)小區(qū)中心4行丹參劃為精確采樣區(qū)，所余8行為非精確采樣區(qū)。

精確采樣區(qū)采樣：將樣區(qū)內(nèi)4行丹參根系完整挖出后去掉地上部分，稱地上部分總鮮質(zhì)量；然后將每株根系分別裝入1個(gè)樣品袋并編號(hào)，統(tǒng)計(jì)實(shí)際收獲株數(shù)，每小區(qū)合并1袋，帶回研究室，洗凈根系稱單株鮮質(zhì)量，觀察統(tǒng)計(jì)單株根系條數(shù)；統(tǒng)計(jì)樣區(qū)根結(jié)線蟲侵染率；烘干稱樣區(qū)總干質(zhì)量。

非精確采樣區(qū)采樣：將非精確采樣區(qū)內(nèi)所余8行丹參全部完整挖出，統(tǒng)計(jì)實(shí)際收獲株數(shù)，稱地上部分總鮮質(zhì)量，去土后稱根系總鮮質(zhì)量，觀察統(tǒng)計(jì)樣區(qū)根結(jié)線蟲侵染率，晾干稱總干質(zhì)量。

利用精確采樣區(qū)與非精確采樣區(qū)所得數(shù)據(jù)計(jì)算相關(guān)指標(biāo)。其中丹參出苗率根據(jù)整個(gè)小區(qū)12行數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；丹參死亡率根據(jù)丹參移栽后出苗株數(shù)與收獲時(shí)丹參實(shí)際存活株數(shù)之差計(jì)算；單株根系鮮質(zhì)量和單株根系條數(shù)根據(jù)精確采樣區(qū)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)；莖葉鮮質(zhì)量、根鮮質(zhì)量、根干質(zhì)量、單株根干質(zhì)量以及根結(jié)線蟲侵染率根據(jù)精確采樣區(qū)與非精確采樣區(qū)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2.3 土壤樣品采集與制備

在CK、T0和T20三個(gè)處理中各選取2株長(zhǎng)勢(shì)良好的代表性植株，按照周永強(qiáng)等方法采集土壤樣品：去掉表層1 cm土壤，盡可能挖取完整根系及其密集分布區(qū)內(nèi)的土壤，將樣品裝入新購(gòu)自封袋。所采樣品編號(hào)后帶回實(shí)驗(yàn)室及時(shí)分離。根區(qū)土壤：將附著在丹參根系上的土抖落至自封袋中，混勻，稱取10.0 g，置于裝有少量石英砂和90 mL無(wú)菌水的三角瓶中，在搖床上振蕩30 min后備用。根表土壤：指將根系上附著的大量土抖落后根表面仍粘附的少量土壤。將已抖落丹參根區(qū)土壤的須根剪下，稱質(zhì)量(W1)后置于裝有90 mL無(wú)菌水的三角瓶中，手搖振蕩1—2 min，待根表面粘附的土壤洗下即可，取出根系，用吸水紙將根表面水吸干后稱根系質(zhì)量(W2)，W1-W2即為根表土質(zhì)量[10]。

使用無(wú)菌小刀從供試根系樣品中截取直徑約5 mm且較均勻的根系各5段，用自來(lái)水沖洗干凈，再用吸水紙吸干根表水分，在體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇溶液中處理30 s，除去根表氣泡，然后將其在濃度為1 g/L的升汞溶液中浸泡消毒。此消毒時(shí)間需在分離前進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)確定，以確保根系表面消毒徹底而又不影響內(nèi)部微生物存活。將根系樣品浸泡消毒完畢后用無(wú)菌水沖洗5次，分別放入加有一小勺滅菌石英砂和10 mL無(wú)菌水的無(wú)菌研缽充分研磨，使根內(nèi)的微生物釋放出來(lái)。研磨好的樣品采用稀釋平皿涂抹法進(jìn)行分離培養(yǎng)。

1.2.4 微生物分離計(jì)數(shù)

細(xì)菌、真菌和放線菌分離測(cè)數(shù)均采用稀釋平皿涂抹法，所用培養(yǎng)基分別為BPA、PDA及GA，28℃培養(yǎng)，計(jì)數(shù)后挑取優(yōu)勢(shì)菌菌落，純化、保藏、備用。

1.2.5 優(yōu)勢(shì)菌種鑒定

采用酶解法提取細(xì)菌、放線菌總DNA[11-13]。用細(xì)菌16S rRNA通用引物(27F：5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′；1541R：5′-AAG GAG GTG ATC CAG CCG CA-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長(zhǎng)度為1.4—1.5 kp的片段。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性4 min，94℃變性1 min，57℃退火55 s，72℃延長(zhǎng)2 min，變性到延長(zhǎng)30個(gè)循環(huán)，72℃延長(zhǎng)10 min，4℃保存。真菌總DNA提取采用CTAB法[14-16]。參照Pryce等方法對(duì)rDNA-ITS序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增[17]。擴(kuò)增引物采用通用引物ITS1和ITS4，分別為5′-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G -3′(ITS1)和5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC -3′(ITS4)，得到長(zhǎng)度為400—500 pb的片段。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延長(zhǎng)40 s，變性到延長(zhǎng)30個(gè)循環(huán)，72℃延長(zhǎng)10 min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物膠純化后送南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。將獲得序列校對(duì)后，采用BLAST方法從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中調(diào)取相關(guān)序列，采用CLUSTAL X2.0軟件進(jìn)行同源性分析，采用Mega 4.0軟件中Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理與分析

丹參出苗率(%)、死亡率(%)、根結(jié)線蟲侵染率(%)以及單株根干質(zhì)量(g/株)的計(jì)算:

(1)

(2)

(3)

(4)

腐植酸鉀蘸根T0處理、放線菌劑Act12+腐植酸鉀配施蘸根處理各指標(biāo)較對(duì)照CK的增率均用ΔCK%表示，用式(5)計(jì)算；放線菌劑Act12+腐植酸鉀配施蘸根處理各指標(biāo)較腐植酸鉀蘸根T0處理的增率用ΔT0%表示，用式(6)計(jì)算。土壤樣品中某種優(yōu)勢(shì)細(xì)菌、真菌及放線菌相對(duì)多度用RA表示，用式(7)計(jì)算[18]。對(duì)照及處理細(xì)菌、真菌和放線菌總數(shù)量及優(yōu)勢(shì)微生物數(shù)量最終數(shù)值均為2個(gè)代表性植株樣品(即重復(fù))的測(cè)定數(shù)據(jù)平均值。數(shù)據(jù)分析用SAS軟件進(jìn)行。

(5)

(6)

(7)

2 結(jié)果與分析

2.1 放線菌劑與腐植酸鉀配施對(duì)丹參的促生作用

由表1、表2可以看出，腐植酸鉀單施、放線菌劑與腐植酸鉀配施均能提高丹參出苗率并降低根結(jié)線蟲侵染率。與對(duì)照CK相比，單施腐植酸鉀T0的丹參出苗率增加1.8%；根結(jié)線蟲侵染率降低9.9%；根鮮質(zhì)量、單株根鮮質(zhì)量、根干質(zhì)量以及單株根干質(zhì)量分別增加25.0%(P<0.05)、17.3%(P<0.05)、28.8%以及11.1%。

表1 放線菌劑與腐植酸鉀配施對(duì)丹參出苗率、死亡率及侵染率的影響

Table 1 Effect of combined actinomycetes with potassium humate on emergence rate, mortality rate and incidence rate ofSalviamiltiorrhizaBge.

處理Treatment出苗率EmergencerateValue/%ΔCK/%ΔT0/%死亡率MortalityrateValue/%ΔCK/%ΔT0/%線蟲侵染率IncidencerateValue/%ΔCK/%ΔT0/%對(duì)照CK83.5±12.6b——33.1±10.0a——7.1±0.3a——腐植酸鉀單施T085.0±10.6b1.8—25.6±9.6ab-22.7—6.4±1.0ab-9.9—Act12與腐植酸鉀(1∶9)配施T1085.3±11.2b2.20.419.6±10.4b-40.8-23.45.7±0.9b-19.7-10.9Act12與腐植酸鉀(1∶19)配施T2090.8±8.0a8.76.820.2±6.7b-39.0-21.13.6±0.3c-49.3-43.8Act12與腐植酸鉀(1∶49)配施T5082.7±12.9b-1.0-2.727.4±8.8ab-17.27.05.3±0.5b-25.4-17.2

Value：測(cè)值數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差A(yù)verage value±Standard deviation；ΔCK：?jiǎn)问┗蚺涫┨幚砀髦笜?biāo)較對(duì)照CK的增率Increased rate of potassium humate or combined application with the control treatment；ΔT0：配施處理各指標(biāo)較腐植酸鉀單施T0處理的增率Increased rate of combined application with the potassium humate application treatment; CK：對(duì)照The control treatment；T0：腐植酸鉀單施Application of potassium humate treatment；T10：Act12與腐植酸鉀(1∶9)配施Combined application of actinomycetes Act12 bio-control agents and potassium humate treatment (1∶9)；T20：Act12與腐植酸鉀(1∶19)配施Combined application of actinomycetes Act12 bio-control agents and potassium humate treatment (1∶19)；T50：Act12與腐植酸鉀(1∶49)配施Combined application of actinomycetes Act12 bio-control agents and potassium humate treatment (1∶49); 同列數(shù)據(jù)后標(biāo)不同小寫字母者表示差異顯著(P<0.05) Different letters in the same column indicate significant difference (P<0.05)

表2 放線菌劑與腐植酸鉀配施對(duì)丹參生物量的影響Table 2 Effect of combined actinomycetes with potassium humate on biomass of Salvia miltiorrhiza Bge.

從表1、表2看出，菌劑與腐植酸鉀配施T20處理各指標(biāo)的處理效應(yīng)最好。該處理丹參出苗率較對(duì)照CK增加8.7%(P<0.05)，收獲時(shí)的死亡率及線蟲侵染率分別較對(duì)照CK減少39.0%及49.3%(P<0.05)。根系鮮質(zhì)量、根系干質(zhì)量分別較對(duì)照CK增加了28.6%(P<0.05)、36.3%(P<0.05)，其余指標(biāo)差異不大。

表1、表2中，ΔT0為菌劑效應(yīng)。在處理T20(配施比1∶19)中，放線菌劑的作用在3種配施處理中效果最好。丹參出苗率較純腐植酸鉀T0增加6.8%，死亡率及根結(jié)線蟲侵染率分別較T0降低21.1%及43.8%，根鮮質(zhì)量較T0增加2.9%(P<0.05)，其余指標(biāo)差異不大。

2.2 放線菌劑處理丹參根域土壤微生物區(qū)系

2.2.1 根區(qū)土壤

如表3所示，在丹參根區(qū)土壤中，與對(duì)照CK相比，腐植酸鉀單施、放線菌劑與腐植酸鉀配施都能明顯降低土壤細(xì)菌、放線菌數(shù)量。單施腐植酸鉀T0處理的細(xì)菌、真菌和放線菌數(shù)量分別較對(duì)照CK減少33.3%、5.1%和26.5%；B/F、A/F和B/A值分別較對(duì)照CK減少29.4%、23.0%和8.6%。

菌劑與腐植酸鉀配施(1∶19)T20處理的細(xì)菌和放線菌數(shù)量分別較對(duì)照CK減少31.3%和20.6%，但真菌數(shù)量顯著增加52.3%(P<0.05)；B/F、A/F以及B/A值分別較對(duì)照CK減少56.4%、47.6%以及16.5%。從生防菌劑的效應(yīng)ΔT0看，菌劑對(duì)細(xì)菌和放線菌數(shù)量影響不大，真菌數(shù)量增加59.5%；B/F、A/F值分別增加38.3%、31.9%。

表3 放線菌與腐植酸鉀配施丹參根域土壤微生物數(shù)量及3大類群組成比例Table 3 Microbial quantities and ratio of the three major microbial groups of S. miltiorrhiza root domain soil

B/F：細(xì)菌與真菌數(shù)量之比The ratio of bacteria to fungi；A/F：放線菌與真菌數(shù)量之比The ratio of actinomycetes to fungi；B/A：細(xì)菌與放線菌數(shù)量之比The ratio of bacteria to actinomycetes

2.2.2 根表土壤

由表3可以看出，在根表土壤中，腐植酸鉀處理可以增加細(xì)菌和真菌數(shù)量，菌劑與腐植酸鉀配施能增加真菌和放線菌數(shù)量。

在單施腐植酸鉀T0處理中，細(xì)菌、真菌數(shù)量分別較對(duì)照CK增加125.6%、103.3%，放線菌數(shù)量差異不明顯；B/F、B/A分別增加10.2%、120.7%，A/F減少50.2%。

菌劑與腐植酸鉀配施T20處理中，細(xì)菌數(shù)量變化不大，真菌、放線菌數(shù)量分別較對(duì)照CK增加133.3%、356.4%(P<0.05)。B/F、B/A值分別降低57.1%、78.4%，A/F值增加95.0%。

從生防菌劑的效應(yīng)ΔT0看，在T20處理中，菌劑使細(xì)菌數(shù)量較T0處理減少55.7%，真菌和放線菌數(shù)量分別增加14.8%和345.0%；B/F、B/A值分別降低61.1%、90.2%，A/F值增加291.8%。

2.2.3 根系

由表3可知，在丹參根系內(nèi)，腐植酸鉀單施、放線菌劑與腐植酸鉀配施都能使細(xì)菌數(shù)量有所增加。但是，丹參植株根系內(nèi)未檢測(cè)到真菌和放線菌存在。

2.3 放線菌處理丹參根域土壤中的優(yōu)勢(shì)微生物

采用16S rRNA序列和rDNA-ITS序列分析技術(shù)分別對(duì)丹參根區(qū)、根表土壤樣品中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌、放線菌和真菌種類進(jìn)行分子鑒定，共獲得13株優(yōu)勢(shì)菌，其中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌5株，優(yōu)勢(shì)真菌2株，放線菌6株(表4)。

表4 丹參根區(qū)根表土壤中的優(yōu)勢(shì)微生物Table 4 Identification of the predominant microorganism in S. miltiorrhiza rhizosphere and rhizoplane soils

2.3.1 細(xì)菌

由表5可以看出，在根區(qū)土壤中，菌劑與腐植酸鉀配施T20處理的放射型根瘤菌(R.radiobacter, YB2)數(shù)量較腐植酸鉀T0處理增加120.0%，較對(duì)照CK增加57.1%；弗雷德里克斯堡假單胞菌(P.frederiksbergensis, YB3)數(shù)量較腐植酸鉀T0處理減少40.0%，較對(duì)照CK減少33.3%；球形節(jié)桿菌(Ar.globiformis, YB4)和耐寒短桿菌(B.frigoritolerans, YB5)數(shù)量較腐植酸鉀T0處理分別增加37.1%和50.0%，較對(duì)照CK分別減少21.3%和60.0%；菌劑與腐植酸鉀配施T20處理較腐植酸鉀T0處理各優(yōu)勢(shì)細(xì)菌相對(duì)多度變化與數(shù)量變化趨勢(shì)一致。此外，腐植酸鉀T0處理使硝基愈瘡木膠節(jié)桿菌(A.nitroguajacolicus, YB1)、放射型根瘤菌(R.radiobacter, YB2)、球形節(jié)桿菌(A.globiformis, YB4)和耐寒短桿菌(B.frigoritolerans, YB5)數(shù)量分別較對(duì)照CK減少54.5%、28.6%、42.6%和73.3%。

在根表土壤中，放射型根瘤菌(R.radiobacter, YB2)和球形節(jié)桿菌(A.globiformis, YB4)數(shù)量在菌劑與腐植酸鉀配施T20處理下較腐植酸鉀T0處理分別增加211.1%和60.3%，較對(duì)照CK分別增加180.0%和48.8%；耐寒短桿菌(B.frigoritolerans, YB5)在菌劑與腐植酸鉀配施T20處理下的數(shù)量分別較腐植酸鉀T0處理和對(duì)照CK減少50.0%和55.6%；硝基愈瘡木膠節(jié)桿菌(A.nitroguajacolicus, YB1)、弗雷德里克斯堡假單胞菌(P.frederiksbergensis, YB3)在菌劑與腐植酸鉀配施T20處理下數(shù)量分別較腐植酸鉀T0處理減少16.7%、68.3%，但是分別達(dá)到對(duì)照CK的7.5倍、2.4倍。此外，腐植酸鉀T0處理的硝基愈瘡木膠節(jié)桿菌(A.nitroguajacolicus, YB1)、弗雷德里克斯堡假單胞菌(P.frederiksbergensis, YB3)數(shù)量分別是對(duì)照CK的9倍、7.5倍。

表5 丹參根區(qū)、根表土壤優(yōu)勢(shì)細(xì)菌數(shù)量及相對(duì)多度RATable 5 Predominant bacteria quantity and relative abundance in S. miltiorrhiza rhizosphere and rhizoplane soils

在丹參根系中，放射型根瘤菌(R.radiobacter, YB2)在菌劑與腐植酸鉀配施T20處理中的數(shù)量較腐植酸鉀T0處理減少16.4%，在對(duì)照CK中未檢出；弗雷德里克斯堡假單胞菌(P.frederiksbergensis, YB3)在菌劑與腐植酸鉀配施T20處理下的數(shù)量約為腐植酸鉀T0處理的43倍及對(duì)照CK的14倍。

硝基愈瘡木膠節(jié)桿菌(A.nitroguajacolicus, YB1)、放射型根瘤菌(R.radiobacter, YB2)和弗雷德里克斯堡假單胞菌(P.frederiksbergensis, YB3)在丹參根表土壤和根系中的大量存在說(shuō)明，它們有可能對(duì)植株的生長(zhǎng)起到了一定的促進(jìn)作用。

2.3.2 真菌

從表6可知，在丹參根區(qū)土壤中，極細(xì)枝孢(C.tenuissimum, YF1)和枝孢芽枝菌(C.cladosporioides, YF2)在菌劑與腐植酸鉀配施T20處理中的數(shù)量分別較腐植酸鉀T0處理增加41.6%和96.3%；在腐植酸鉀T0處理、菌劑與腐植酸鉀配施T20處理中，極細(xì)枝孢(C.tenuissimum, YF1)數(shù)量分別較對(duì)照CK減少54.4%、35.4%，而枝孢芽枝菌(C.cladosporioides, YF2)數(shù)量約分別為對(duì)照CK的2倍、4倍。

在根表土壤中，極細(xì)枝孢(C.tenuissimum, YF1)在菌劑與腐植酸鉀配施T20處理中的數(shù)量約為腐植酸鉀T0處理的2倍，在對(duì)照CK中未檢測(cè)到；枝孢芽枝菌(C.cladosporioides, YF2)在菌劑與腐植酸鉀配施T20處理中的數(shù)量分別較腐植酸鉀T0、對(duì)照CK處理減少37.8%、35.8%。

表6 丹參根區(qū)、根表土壤中優(yōu)勢(shì)真菌數(shù)量及相對(duì)多度RATable 6 Predominant fungi quantity and relative abundance in S. miltiorrhiza rhizosphere and rhizoplane soils

2.3.3 放線菌

從表7可知，在丹參根區(qū)土壤中，腫痂鏈霉菌(S.turgidiscabies, YA1)、淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌(S.diastatochromogenes, YA2)和磚紅鏈霉菌(S.lateritius, YA3)在菌劑與腐植酸鉀配施T20處理中的數(shù)量分別較腐植酸鉀T0增加14.3%、23.1%和72.7%，分別較對(duì)照CK增加100.0%、68.4%和46.2%；陜西鏈霉菌(S.shaanxiensis, YA4)、純白鏈霉菌(S.candidus, YA5)分別較腐植酸鉀T0減少68.8%、63.6%，分別較對(duì)照CK減少54.5%、81.0%。

在根表土壤中，磚紅鏈霉菌(S.lateritius, YA3)和陜西鏈霉菌(S.shaanxiensis, YA4)在菌劑與腐植酸鉀配施T20處理中的數(shù)量分別較腐植酸鉀T0處理增加18.2%和33.3%；腫痂鏈霉菌(S.turgidiscabies, YA1)、淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌(S.diastatochromogenes, YA2)和純白鏈霉菌(S.candidus, YA5)在菌劑與腐植酸鉀配施T20處理中的數(shù)量較腐植酸鉀T0處理的減少43.2%—100.0%。

腐植酸鉀T0、菌劑與腐植酸鉀配施T20處理均使磚紅鏈霉菌(S.lateritius, YA3)和陜西鏈霉菌(S.shaanxiensis, YA4)較對(duì)照CK增加20.0%—85.7%；腫痂鏈霉菌(S.turgidiscabies, YA1)、淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌(S.diastatochromogenes, YA2)和純白鏈霉菌(S.candidus, YA5)在菌劑與腐植酸鉀配施T20處理中的數(shù)量較對(duì)照CK減少47.5%—100.0%；卡伍爾鏈霉菌(S.cavourensis, YA6)僅在菌劑與腐植酸鉀配施T20處理丹參根表土壤中檢測(cè)到，且其數(shù)量高達(dá)15.2×105cfu/g。

表7 丹參根區(qū)、根表土壤中優(yōu)勢(shì)放線菌數(shù)量及相對(duì)多度RATable 7 Predominant actinomycetes quantity and relative abundance in S. miltiorrhiza rhizosphere and rhizoplane soils

3 小結(jié)與討論

根域土壤微生物對(duì)作物根系發(fā)育及健康生長(zhǎng)影響很大，故在植物水分、養(yǎng)分吸收過程中起著非常重要的作用。因此植物能否健康生長(zhǎng)與根域微生態(tài)系統(tǒng)中的微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。接種生防放線菌可通過增加有益微生物抑制有害微生物改善植株根域土壤微生物區(qū)系，調(diào)整微生態(tài)平衡，形成有利于作物根系健康生長(zhǎng)的環(huán)境，從而維持或促進(jìn)植株正常生長(zhǎng)。

在利用防病促生活菌制劑防治土傳根系病害的研究中，單施菌劑的研究較多，探索菌劑與肥料配合施用效果及機(jī)理的研究較少。申光輝研究發(fā)現(xiàn)，硅肥與放線菌劑配施可有效改善草莓土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，增加土壤細(xì)菌、放線菌數(shù)量及微生物總數(shù)，減少土壤真菌數(shù)量，同時(shí)提高B/F和A/F值，通過恢復(fù)微生物區(qū)系平衡，刺激根系生長(zhǎng)、增加養(yǎng)分吸收等途徑促進(jìn)草莓生長(zhǎng)，提高草莓產(chǎn)量及品質(zhì)[19]。

腐植酸是一種含有羧基、酚羥基、醌基等多種活性基團(tuán)的高分子物質(zhì)，具有改良土壤，提高肥料利用率，促進(jìn)植物生長(zhǎng)的作用[20-22]。研究表明，施用肥料對(duì)土壤理化性質(zhì)以及微生物類群數(shù)量有很大影響[23]。施用腐植酸復(fù)合肥可以提高細(xì)菌、真菌和放線菌數(shù)量[24]，增加土壤活躍微生物量[25]，腐植酸生物活性肥料能夠促進(jìn)土壤有益微生物繁衍，維持其長(zhǎng)時(shí)間的旺盛生命活動(dòng)，還能提高多種土壤酶活性，改良培肥土壤，為植物根系營(yíng)造健康生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境[26]。曹書苗等發(fā)現(xiàn)施入適量的腐植酸鈉能顯著促進(jìn)土壤中接入生防放線菌的繁殖，但是用量過大會(huì)有一定抑制作用[27]。

本研究結(jié)果表明，生防放線菌Act12菌劑與腐植酸鉀配施(1∶19)對(duì)丹參根結(jié)線蟲侵染的抑制作用及生物量和產(chǎn)量的增產(chǎn)效應(yīng)明顯優(yōu)于腐植酸鉀單施。其可能的作用機(jī)制是：腐植酸鉀除了能促進(jìn)丹參生長(zhǎng)外，還可作為接入放線菌的碳源能源物質(zhì)，促進(jìn)該菌大量繁殖[27]，增加了丹參根區(qū)與根表土壤中的有益放線菌數(shù)量，強(qiáng)化了有益放線菌的促生防病作用及對(duì)根區(qū)與根表土壤中微生物區(qū)系的調(diào)節(jié)作用，提高了A/F值，形成了有利于丹參根系健康生長(zhǎng)的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。其中，接種放線菌對(duì)丹參根區(qū)、根表土壤及根系中的優(yōu)勢(shì)微生物種類和數(shù)量影響很大，其中3株優(yōu)勢(shì)細(xì)菌硝基愈瘡木膠節(jié)桿菌(A.nitroguajacolicus, YB1)、放射型根瘤菌(R.radiobacter, YB2)、弗雷德里克斯堡假單胞菌(P.frederiksbergensis, YB3)，3株優(yōu)勢(shì)放線菌淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌(S.diastatochromogenes, YA2)、磚紅鏈霉菌(S.lateritius, YA3)和卡伍爾鏈霉菌(S.cavourensis, YA6)在放線菌處理下數(shù)量較多，可能是促進(jìn)丹參生長(zhǎng)的有益微生物。

有研究表明，硝基愈瘡木膠節(jié)桿菌(A.nitroguajacolicus)可作為油松幼苗菌根圍的高效解有機(jī)磷細(xì)菌[28]。放射型根瘤菌(R.radiobacter)可以合成對(duì)多種疾病都有顯著療效的輔酶Q10[29]。弗雷德里克斯堡假單胞菌(P.frederiksbergensis)是一種菲降解菌，具有抗氧化功能，以及有效降解石油污染物的能力[30]。并且后2株細(xì)菌都可以定殖于丹參根系內(nèi)，通過產(chǎn)生活性代謝產(chǎn)物促進(jìn)植株生長(zhǎng)[31]。磚紅鏈霉菌(S.lateritius)對(duì)金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)有顯著抑制作用[32]，其代謝產(chǎn)物對(duì)革蘭氏陽(yáng)性和陰性菌具有抗菌活性[33]。淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌(S.diastatochromogenes)是一株可以抑制馬鈴薯瘡痂病以及其他根莖類作物黑星病的鏈霉菌[34]。卡伍爾鏈霉菌(S.cavourensis)及其代謝產(chǎn)物對(duì)植物病原真菌有明顯的抑制作用[35]。由此可知，生防放線菌處理下這3株細(xì)菌和3株鏈霉菌數(shù)量的增加，說(shuō)明它們可能通過抑制部分有害微生物生長(zhǎng)，改善微生態(tài)環(huán)境，促進(jìn)丹參生長(zhǎng)。

在放線菌接種處理中，數(shù)量減少的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌耐寒短桿菌(B.frigoritolerans, YB5)和優(yōu)勢(shì)放線菌腫痂鏈霉菌(S.turgidiscabies, YA1)有可能是潛在的有害微生物。研究表明，耐寒短桿菌(B.frigoritolerans)是一種迄今鮮為人知的昆蟲病原菌[36]。腫痂鏈霉菌(S.turgidiscabies)是Miyajima等(1998)發(fā)現(xiàn)的一株馬鈴薯瘡痂病新致病種，它可以產(chǎn)生一類特有的植物性毒素(Thaxtomins)，對(duì)馬鈴薯等作物危害很大[37]。因此，這2株優(yōu)勢(shì)微生物數(shù)量的減少表明放線菌劑處理可以抑制有害微生物生長(zhǎng)，凈化土壤微生態(tài)環(huán)境，有效減少丹參根系病害發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。

此外，鄭曉慧等研究發(fā)現(xiàn)四川西昌市發(fā)生的石榴葉霉病致病病原為極細(xì)枝孢(C.tenuissimum)[38]，何平勛和趙連書發(fā)現(xiàn)該菌可引起落葉松芽枯病，但對(duì)楊樹等銹病有一定的防治作用[39]。枝孢芽枝菌(C.cladosporioides)是一種可以侵染小麥的植物病原菌[40]，但是該菌還被發(fā)現(xiàn)可以與枸杞根系形成共生關(guān)系，有效地促進(jìn)枸杞根系發(fā)育，通過提高枸杞葉片氣孔導(dǎo)度和光合速率來(lái)減輕干旱脅迫的毒害作用[41]。因此，這2株真菌不能簡(jiǎn)單的對(duì)其評(píng)價(jià)是否有害或有益，需要進(jìn)一步研究證明。

目前對(duì)于有機(jī)肥與生防放線菌劑配施促進(jìn)丹參生長(zhǎng)鮮有研究報(bào)道。本試驗(yàn)較為系統(tǒng)的研究了腐植酸鉀與放線菌劑配施對(duì)丹參生長(zhǎng)及根域微生態(tài)體系的影響，發(fā)現(xiàn)菌劑與腐植酸鉀配施對(duì)丹參具有較為明顯的抗病促生作用，特別對(duì)降低根結(jié)線蟲侵染率效果顯著；可有效改變丹參根區(qū)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。表明腐植酸鉀與生防菌劑配施是值得重視和深入研究的菌劑施用方法。值得注意的是，由于丹參個(gè)體差異大，盡管腐植酸鉀單施及其與菌劑混合施用時(shí)丹參根系的干、鮮質(zhì)量、根結(jié)線蟲侵染率及成活率等指標(biāo)與CK差異達(dá)到顯著水平，但其余指標(biāo)在統(tǒng)計(jì)上仍未達(dá)到顯著水平，且菌劑效應(yīng)ΔT0仍較小，表明仍要繼續(xù)進(jìn)行更大面積的試驗(yàn)以確認(rèn)其效果。同時(shí)，對(duì)腐植酸鉀與菌劑配施引起的微生物區(qū)系變化的生態(tài)效應(yīng)及有益微生物的促生機(jī)理尚需進(jìn)一步研究。

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Effects of combined application of actinomycetes Act12 bio-control agents and potassium humate on growth and microbial flora in rooting zone ofSalviamiltiorrhizaBge

DUAN Jiali1, XUE Quanhong1,*, SHU Zhiming2, WANG Dongsheng1, HE Fei2

1CollegeofNaturalResourcesandEnvironment,NorthwestAgricultureandForestryUniversity,Yangling712100,China2CollegeofLifeSciences,NorthwestAgricultureandForestryUniversity,Yangling712100,China

This study was to investigate the effects of combined application of actinomycetes Act12 bio-control agents and potassium humate on growth and microbial flora in rooting zone ofSalviamiltiorrhizaBge.Taking conventional transplantation treatment as control, we used root dipping with actinomycetes Act12 bio-control agents and potassium humate to evaluate survival rate, biomass and resistance to root-knot nematode ofS.miltiorrhiza; The abundances of soil bacteria (B), fungi (F) and actionmycetes (A) were determined using the dilution plating technique. Predominant microorganisms were identified using 16S rRNA and ITS sequence analysis. Results were used to evaluate the microecological changes in soil microflora ofS.miltiorrhiza root zones with combined application of actinomycetes Act12 bio-control agents and potassium humate.The results showed that: 1)Under Act12 combined with potassium humate treatment (T20), emergence rate increased by 8.7% compared with the control treatment, and mortality rate decreased by 39.0%; Stem-leaf natural weight, root natural weight, root natural weight per plant, root dry weight and root dry weight per plant were 6.1%、28.6%、11.1%、36.3% and 9.0% higher than the control, respectively. 2)Combined application of Act12 agents and potassium humate can adjust soil microecological balance, modify microflora and microbial community composition. In rhizoplane soil, compared with the control treatment, A/F increased by 95.0% under Act12 combined with potassium humate treatment. InS.miltiorrhizaroots, under Act12 combined with potassium humate treatment, the number of bacteria was 195.0% higher than the control. While fungi and actinomyctes were not detected. 3)In rhizosphere and rhizoplane soil with Act12 and potassium humate, 6 predominant microorganisms might be beneficial, which included 3 bacteria isolates namelyA.nitroguajacolicus,R.radiobacterandP.frederiksbergensis, 3 actinomycetes isolates namelyS.diastatochromogenes,S.lateritiusandS.cavourensis; 2 predominant microorganisms were suspected harmful isolates, included 1 bacteria isolateB.frigoritoleransand 1 actinomycetes isolateS.turgidiscabies. 4)Combined application of Act12 agents and potassium humate may control the disease of root-knot nematode. The disease incidence of root-knot nematode inS.miltiorrhizadecreased by 49.3% under using Act12 agents combined with potassium humate.These results suggested that the combined application of Act12 bio-control agents and potassium humate not only promotedS.miltiorrhizagrowth and yield, but also enhanced plant disease resistance and adjusted soil microecological balance in rooting zone.

SalviamiltiorrhizaBge.; actinomycetes agents; potassium humate; soil microflora; predominant microorganism

長(zhǎng)江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃(PCSIRT, IRT0748)

2013-05-23;

日期:2014-04-25

10.5846/stxb201305231154

*通訊作者Corresponding author.E-mail: xuequanhong@163.com

段佳麗，薛泉宏，舒志明，王東勝，何斐.放線菌Act12與腐植酸鉀配施對(duì)丹參生長(zhǎng)及其根域微生態(tài)的影響.生態(tài)學(xué)報(bào),2015,35(6):1807-1819.

Duan J L, Xue Q H, Shu Z M, Wang D S, He F.Effects of combined application of actinomycetes Act12 bio-control agents and potassium humate on growth and microbial flora in rooting zone ofSalviamiltiorrhizaBge.Acta Ecologica Sinica,2015,35(6):1807-1819.