郭永紅，問(wèn)嬌，王俊紅(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院，西安 710004)

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利用PCR擴(kuò)增及基因合成構(gòu)建Adnectin半隨機(jī)核糖體展示文庫(kù)

郭永紅，問(wèn)嬌，王俊紅(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院，西安 710004)

摘要：目的構(gòu)建Adnectin半隨機(jī)的核糖體(mRNA)展示文庫(kù)。方法分析Adnectin核糖體展示文庫(kù)結(jié)構(gòu)序列的編碼氨基酸序列，利用無(wú)意突變建立酶切位點(diǎn)，使用PCR擴(kuò)增和基因合成兩種方法相結(jié)合，構(gòu)建Adnectin半隨機(jī)核糖體展示文庫(kù)，通過(guò)限制性內(nèi)切酶及DNA測(cè)序證實(shí)序列正確性，對(duì)文庫(kù)轉(zhuǎn)化菌的滴定和插入失活藍(lán)白菌斑篩查和計(jì)數(shù)測(cè)定計(jì)算文庫(kù)的庫(kù)容。結(jié)果經(jīng)測(cè)序證實(shí)文庫(kù)結(jié)構(gòu)的正確性，文庫(kù)的庫(kù)容為1.54×1013/mL。結(jié)論成功構(gòu)建Adnectin半隨機(jī)的核糖體展示文庫(kù)，方法簡(jiǎn)單，庫(kù)容量大，該文庫(kù)的建成為親和各種相關(guān)蛋白的Adnectin結(jié)合序列奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：Adnectin；PCR擴(kuò)增；基因合成；核糖體展示文庫(kù)

Adnectins是基于Ⅲ型纖維連接蛋白第10結(jié)構(gòu)域(10Fn3)所設(shè)計(jì)衍生的半人工蛋白分子，可以模擬抗體結(jié)合靶蛋白分子，具有高親和力、高特異性、反復(fù)使用不產(chǎn)生抗體等優(yōu)點(diǎn)[1]，被認(rèn)為是有極好應(yīng)用前景的蛋白藥物[2]。核糖體展示技術(shù)是利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因文庫(kù)，同時(shí)引入啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位、間隔序列、5′端和3′端莖環(huán)結(jié)構(gòu)，然后在體外無(wú)細(xì)胞系中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯[3]，利用體外表達(dá)體系以mRNA—核糖體—抗體三元復(fù)合物的形式將基因型和表型聯(lián)系起來(lái)用于抗體開發(fā)的技術(shù)。采用體外構(gòu)建、篩選的方法改造抗體，避免了噬菌體展示技術(shù)轉(zhuǎn)化步驟的限制，更易構(gòu)建出高容量、高質(zhì)量的文庫(kù)篩選出特異性蛋白，為制備小分子蛋白質(zhì)或多肽開辟了一條新途徑[4]。2012年6月～2013年3月，本研究利用基因合成和PCR擴(kuò)增兩者相結(jié)合方法，成功地構(gòu)建了Adnectin半隨機(jī)的核糖體(mRNA)展示文庫(kù)，該文庫(kù)的建成為親和各種相關(guān)蛋白的Adnectin結(jié)合序列奠定了基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料pGEM-Teasy載體及菌種Ecoli DH5α和TOP10菌種均由本實(shí)驗(yàn)室保存，質(zhì)粒pES+G18602由華廣生物有限公司提供。限制性內(nèi)切酶、DNA Marker、DNA連接試劑盒均購(gòu)自TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司。PCR產(chǎn)物純化試劑盒和凝膠回收試劑盒為Qiagen quick Gel Extraction Kit(Cat28704)；質(zhì)粒小量抽提試劑盒及基因合成為上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司提供，其余試劑均為分析純。

1.2方法

1.2.1基因合成結(jié)合PCR擴(kuò)增構(gòu)建文庫(kù)設(shè)計(jì)方法Adnectin核糖體(mRNA)展示文庫(kù)結(jié)構(gòu)和序列：T7 promoter-5′-stem loop-ribosome binding site-Adnectin library-spacer-3′-stem loop，使用基因合成方法合成文庫(kù)的兩側(cè)翼序列：T7 promoter-5′-stem loop-ribosome binding site-SpeI-spacer-Hind Ⅲ-3′-stem loop序列，使用PCR方法合成半隨機(jī)文庫(kù)-SpeI-spacer-Hind Ⅲ序列，使用限制性內(nèi)切酶Spe Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切后將半隨機(jī)文庫(kù)插入到合成兩翼序列載體中，使半隨機(jī)文庫(kù)5′端加載核糖體展示需要的T7啟動(dòng)子、莖環(huán)結(jié)構(gòu)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)和起始密碼子，3′端加載莖環(huán)結(jié)構(gòu)和間隔序列，建立插入Adnectin核糖體(mRNA)展示文庫(kù)的質(zhì)粒載體。半隨機(jī)文庫(kù)的酶切點(diǎn)Spe Ⅰ的選擇是依據(jù)對(duì)Adnectin核糖體(mRNA)展示文庫(kù)結(jié)構(gòu)序列的編碼氨基酸序列分析后，使用無(wú)意突變后確定，第152及155位核苷酸為突變處，原序列ACCAGC突變后ACTAGT，編碼相同的氨基酸-TS-，ACTAGT序列成為了可以使用的Spe Ⅰ酶識(shí)別點(diǎn)。把需要構(gòu)建的如下序列分成了兩個(gè)區(qū)，使用PCR方法擴(kuò)增半隨機(jī)文庫(kù)-Spe Ⅰ-spacer-Hind Ⅲ序列，由GATCAG開始到AAGCTTG，余序列由基因合成后連接入pES+G18602質(zhì)粒。需要構(gòu)建的全序：ATACGAAATTAATACGACTCACTATAGG-GAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTG-TTTAACTTTAAGAAGGAGATATATCCATGGACTAC-AAAGACGTTTCTGATGTTCCGAGGGACCTGGAAGT-TGTTGCTGCGACCCCCACTAGTCTACTGATCAGCT-GGNNBNNBNNBNNBNNBNNBNNBTATTACAGGAT-CACTTACGGAGAAACAGGAGGAAATAGCCCTGTC-CAGGAGTTCACTGTGCCTNNBNNBNNBNNBNNBG-CTACCATCAGCGGCCTTAAACCTGGAGTTGATTAT-ACCATCACTGTGTATGCTGTCACTNNBNNBNNBNN-BNNBNNBNNBNNBNNBNNBCCAATTTCCATTAATT-ACCGAACAGAAATTGACAAACCATCCCAGGGCTTT-AATGAAAAGCTTGATCCATTCGTTTGTGAATATCA-AGGCCAATCGTCTGACCTGCCTCAACCTCCTGTCA-ATGCTGGCGGCGGCTCTGGTGGTGGTTCTGGTGGC-GGCTCTGAGGGTGGTGGCTCTGAGGGTGGCGGTTC-TGAGGGTGGCGGCTCTGAGGGAGGCGGTTCCGGTG-GTGGCTCTGGTTCCGGTGATTTTGATTATGAAAAG-ATGGCAAACGCTAATAAGGGGGCTATGACCGAAA-ATGCCGATGAAAACGCGCTACAGACCGCACACCT-TACTGGTGTGCGG。其中N表示A、C、G、T 4種堿基隨機(jī)；B表示C、G兩種隨機(jī)堿基；TAATA為T7促進(jìn)子；ATGGAC開始為文庫(kù)序列；GATCCA開始為間隔序列；ACCGC開始為莖環(huán)結(jié)構(gòu)。

1.2.2PCR擴(kuò)增半隨機(jī)文庫(kù)方法首先，使用含有第三helix bundle的F1引物和R1引物做PCR擴(kuò)增，獲得產(chǎn)物作為二次PCR的模板；再使用F2和R2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物作為反應(yīng)模板，使用含有第二helix bundle的F3引物和R3引物擴(kuò)增后產(chǎn)物用于下一次PCR反應(yīng)模板，在以后的PCR反應(yīng)中F向引物依次增加，R向引物一直使用R3引物，直至F6和R3引物擴(kuò)增后得到產(chǎn)物。半隨機(jī)文庫(kù)PCR引物：F1：GTGTAT GCTGTCACTN NBNNBNNBNN BNNBNNBNNB NNBNNBNNBC CAATTTCCAT T；R1：GTTTGTCA ATTTCTGTTC GGTAATTAAT GGAAATTGG；F2：T CAG CGGCCTTAAA CCTGGAGTTG ATTATACCAT CACTGTGTAT GCTGTCAC-T；R2：GCTTTTCATT AAAGCCCTGG GATGGTTTGT CAATTTCTG；F3：CCTGTCCAGG AGTTCACTGT GCCTNNBNNB NNBNNBNNBG CTACCATCAG CGGCC；R3：CAA GCTTTTCATT AAAGCCC；F4：TATTACAGG ATCACTTACG GAGAAACAGG AGGAAATAGC CCTGTCCAGG AGTTC；F5：GTCTACT GATCAGCTGG NNBNNBNNBN NBNNBNNBNN BTATTACAGG ATCACTTAC；F6：CA CTAGTCTACT GATCAGCTGG。其中N表示A、C、G、T 4種堿基隨機(jī)，B表示C、G兩種隨機(jī)堿基。

1.2.3半隨機(jī)文庫(kù)的構(gòu)建方法PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 40 s；56 ℃ 1 min；72 ℃ 1 min；18個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，以25 μL PCR反應(yīng)體系進(jìn)行。PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，擴(kuò)增成功的PCR產(chǎn)物以膠回收試劑盒進(jìn)行純化回收，為增加文庫(kù)容量，每次PCR使用5 μL產(chǎn)物做模板，在5個(gè)平行管內(nèi)擴(kuò)增，產(chǎn)物混合后作為模板使用。將PCR純化產(chǎn)物與pGEM-Teasy質(zhì)粒載體16 ℃連接過(guò)夜，最后的PCR產(chǎn)物全部插入到pGEM-Teasy質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)Top10受體菌，取感受態(tài)菌100 μL加重組體10 μL，常規(guī)方法操作，共轉(zhuǎn)導(dǎo)100管受體菌，50管菌體做LB(Luria-Bertani)—氨基芐青霉素(Amp)固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，挑取單菌落進(jìn)行Spe Ⅰ及Hind Ⅲ雙酶切鑒定，切膠回收酶切產(chǎn)物。

1.2.4重組pES+G18602載體的構(gòu)建方法DNA連接試劑盒連接，16 ℃過(guò)夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，37 ℃培養(yǎng)16～18 h，將PCR產(chǎn)物連接入含有合成基因的pES+G18602載體，挑取單菌落進(jìn)行酶切鑒定，篩選正確的菌落20個(gè)克隆送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，采用Pubmed Blast進(jìn)行序列檢索比對(duì)。

1.2.5文庫(kù)容量計(jì)算方法50管菌體經(jīng)倍比稀釋轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10，取轉(zhuǎn)化菌10 μL涂布于表面涂有X-gal(Galactoside)和IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)的含Amp瓊脂糖平板上，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。藍(lán)白班篩選計(jì)數(shù)細(xì)菌轉(zhuǎn)化克隆和計(jì)算文庫(kù)容量。

2結(jié)果

2.1PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1。

注：A為DNA Marker，分子量從下到上分別是100、200、300、400、500、600、750、1 000、1 314、1 614、2 011、3 000、4 000、5 000、6 000和12 000 bp；B為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，分子量為263 bp。

圖1PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳鑒定圖

2.2重組pGEM-Teasy-Adnectin質(zhì)粒酶切電泳鑒定結(jié)果見圖2。

注：A為DNA Marker，分子量從下到上分別為100、200、300、400、500、600、750、1 000、1 314、1 614、2 011、3 000、4 000、5 000、6 000和12 000 bp；B為限制性內(nèi)切酶SpⅠ及HindⅢ酶切產(chǎn)物，分子量為263 bp。

圖2重組pGEM-Teasy-Adnectin質(zhì)粒酶切電泳圖

2.3文庫(kù)轉(zhuǎn)化菌克隆的測(cè)序結(jié)果20個(gè)送檢測(cè)序的克隆，僅有13個(gè)克隆測(cè)序顯示具有完整的three-helix bundle結(jié)構(gòu)，經(jīng)Blast比對(duì)序列完全符合，見插頁(yè)Ⅰ圖1。其余7個(gè)克隆僅有two-helix bundle結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生的原因可能和該插入序列多發(fā)夾結(jié)構(gòu)使測(cè)序信號(hào)中斷有關(guān)，可能也同PCR擴(kuò)增產(chǎn)生錯(cuò)誤有關(guān)。

2.4文庫(kù)容量計(jì)算結(jié)果對(duì)文庫(kù)轉(zhuǎn)化菌的滴定和插入失活藍(lán)白菌斑篩查和計(jì)數(shù)，最終獲得純化的PCR產(chǎn)物15.4 μg，文庫(kù)的庫(kù)容為1.54×1013/mL。

3討論

10Fn3獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和良好的生物物理特性決定其最適合作為蛋白支架。10Fn3是最早被研究、也是最具臨床應(yīng)用前景的支架蛋白[5～7]，其結(jié)構(gòu)與抗體可變區(qū)相似，適合裝配多功能分子；10Fn3不包含二硫鍵或自由巰基，這種結(jié)構(gòu)特點(diǎn)保證了其在高溫和還原環(huán)境下的穩(wěn)定性，并且能在細(xì)菌內(nèi)高效表達(dá)活性產(chǎn)物[8]；10Fn3作為蛋白支架，其本身無(wú)毒性和免疫原性；10Fn3的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)是它可以天然適合多聚化產(chǎn)生多功能連接分子。10Fn3中的3個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)(BC、DE和FG)在結(jié)構(gòu)上與抗體分子的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)中的H1、H2及H3同源，改變?cè)撎幍陌被嵝蛄袆t可以使其理論上能與任何配體分子特異結(jié)合[9]。

Adnectins是基于10Fn3所設(shè)計(jì)的一類半人工蛋白分子，對(duì)于目標(biāo)靶分子高親和力和高特異性的特性使得Adnectins被認(rèn)為是未來(lái)最具應(yīng)用前景的蛋白藥物[10～12]。

目前，報(bào)道篩選出的Adnectins有20個(gè)左右，靶分子包括泛素、TNF-α、溶菌酶、SARS病毒N蛋白、EGFR、VEGF-R2等[13～16]，篩選方法包括噬菌體展示系統(tǒng)、酵母展示技術(shù)、酵母雙雜交技術(shù)及核糖體mRNA展示技術(shù)等，篩選出的Adnectin與靶分子的親和力不乏與抗原抗體之間親和力相媲美者。其中，針對(duì)VEGF-R2的Adnectin和CT-322已經(jīng)批準(zhǔn)進(jìn)入二期臨床試驗(yàn)，用于多形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、非小細(xì)胞肺癌及轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌的治療[17～19]。

核糖體展示技術(shù)是針對(duì)大容量基因庫(kù)高效篩選功能基因的有效方法之一，其相比于目前的體內(nèi)展示技術(shù)(噬菌體展示技術(shù)、酵母表面展示技術(shù))有兩個(gè)關(guān)鍵的特性：首先，篩選不受轉(zhuǎn)化效率的限制，可針對(duì)大容量基因庫(kù)進(jìn)行富集篩選；其次，在PCR過(guò)程中可引入點(diǎn)突變改變功能蛋白的專一性和親和性，同時(shí)通過(guò)核糖體—蛋白質(zhì)—mRNA三聯(lián)體的配體結(jié)合反應(yīng)選擇功能蛋白。通過(guò)核糖體展示文庫(kù)篩選Adnectins，可以構(gòu)建更大庫(kù)容的庫(kù)。經(jīng)過(guò)參閱相關(guān)文獻(xiàn)，設(shè)計(jì)選擇合成長(zhǎng)片段和PCR的方法構(gòu)建用于轉(zhuǎn)錄和篩選的DNA鏈。半隨機(jī)文庫(kù)的酶切點(diǎn)Spe Ⅰ的選擇是依據(jù)對(duì)原Adnectin核糖體(mRNA)展示文庫(kù)結(jié)構(gòu)序列的編碼氨基酸序列分析后，使用無(wú)意突變后確定，第152及155位核苷酸為突變處，原序列ACCAGC突變后ACTAGT，編碼相同的氨基酸-TS-，ACTAGT序列成為了可以使用的Spe Ⅰ酶識(shí)別點(diǎn)。使用PCR方法擴(kuò)增半隨機(jī)文庫(kù)-Spe Ⅰ-spacer-Hind Ⅲ序列，使用基因合成方法合成文庫(kù)的兩側(cè)翼序列，即T7 promoter-5′-stem loop-ribosome binding site—Spe Ⅰ-spacer -Hind Ⅲ-3′-stem loop序列。這樣可以使用內(nèi)切酶Spe Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切后將半隨機(jī)文庫(kù)文庫(kù)插入到合成兩翼序列載體中，使半隨機(jī)文庫(kù)文庫(kù)5′端加載核糖體展示需要的T7啟動(dòng)子、莖環(huán)結(jié)構(gòu)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)和起始密碼子，3′端加載莖環(huán)結(jié)構(gòu)和間隔序列，建立插入Adnectin核糖體(mRNA)展示文庫(kù)的質(zhì)粒載體，且整個(gè)核糖體展示模板不存在終止密碼子，保證mRNA-核糖體—蛋白質(zhì)以復(fù)合物的形式存在。目前，DNA合成技術(shù)已非常成熟，能保證合成的長(zhǎng)DNA鏈的準(zhǔn)確性；PCR過(guò)程中以多投入引物、減少循環(huán)次數(shù)的方法減少偏倚；每次反應(yīng)后進(jìn)行長(zhǎng)度檢測(cè)，將終產(chǎn)物克隆入質(zhì)粒載體，進(jìn)行多個(gè)克隆的序列分析，推算文庫(kù)的多樣性；通過(guò)這些措施，保證文庫(kù)的質(zhì)量，而引物的設(shè)計(jì)是決定文庫(kù)多樣性的關(guān)鍵。經(jīng)限制性內(nèi)切酶及DNA測(cè)序證實(shí)了文庫(kù)結(jié)構(gòu)的正確性和文庫(kù)序列的多樣性，對(duì)文庫(kù)轉(zhuǎn)化菌的滴定和插入失活藍(lán)白菌斑篩查和計(jì)數(shù)測(cè)定計(jì)算，文庫(kù)的庫(kù)容為1.54×1013/mL。

綜上所述，使用基因合成和PCR擴(kuò)增兩者相結(jié)合的方法，成功的構(gòu)建了Adnectin半隨機(jī)的核糖體(mRNA)展示文庫(kù)。該文庫(kù)構(gòu)建方法較之前傳統(tǒng)方法簡(jiǎn)單，成本低，庫(kù)容量大，為構(gòu)建親和各種相關(guān)蛋白的Adnectin結(jié)合序列奠定了基礎(chǔ)。

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Construction semi-random Adnectin ribosome display library by PCR amplification

and gene synthesis

GUOYong-hong,WENJiao,WANGJun-hong

(TheSecondAffiliatedHospitalofXi′anJiaotongUniversity,Xi′an710004,China)

Abstract:ObjectiveTo construct semi-random Adnectin ribosome display library. MethodsAdnectin ribosome display library was constructed by PCR amplification combining with gene synthesis method. PCR products contained the restrictive sites of SpeⅠbased on nonsense mutation. The recombinant plasmids were identified by restriction endonuclease enzyme analysis and DNA sequence. The positive recombinant clones were screened and library capacity was measured by blue-white test. ResultThe library was confirmed by sequencing and library capacity was 1.54×1013/mL. ConclusionsTo corstruct successful Adnectin semi-random ribosomes display library (mRNA) used simple and easy method. The built library laid the foundation for Adnectin affinity with various related protein.

Key words:Adnectin; PCR amplification; gene synthesis; ribosomes display library

(收稿日期：2014-09-24)

中圖分類號(hào)：Q784

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-266X(2015)04-0004-04

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.04.002

通信作者簡(jiǎn)介：王俊紅(1970-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，研究方向?yàn)榛蛑委煓C(jī)制。E-mail: jhwangdoctor@sohu.com

作者簡(jiǎn)介：第一郭永紅(1971-)，女，博士，副主任醫(yī)師，研究方向?yàn)楦斡不案伟┑姆肿訖C(jī)制。E-mail: xiaoqing9759@sina.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(81100300)。