石嘉懌 張檬達 鞠興榮

(南京財經(jīng)大學食品科學與工程學院，南京 210046)

稻谷是世界上最重要的谷物之一，也是中國的主要糧種［1］，年產(chǎn)量可達 1.8 億 t［2］。稻谷在儲藏期間，由于呼吸氧化作用和各種酶的作用，其品質(zhì)必然會隨著儲藏時間的延長而發(fā)生變化，甚至劣變［3］，Kaminski等［4］和 Michael等［5］利用分光光度法對谷物中的揮發(fā)性成分進行研究，表明稻谷的揮發(fā)性成分會隨著儲藏時間的延長而發(fā)生變化，但該分析方法并未對各個揮發(fā)性組分進行鑒定。

頂空固相微萃取(SPME)具有操作簡單、樣品制備時間短、精確性高、成本低及安全等特點，特別適合萃取含量微小的揮發(fā)、半揮發(fā)性物質(zhì)［6］。趙峰等［7］，吳繼紅等［8］分別采用此方法分析蘋果中的芳香成分，測得了含量較少的醇類和酯類物質(zhì)。近年來，利用頂空固相微萃取技術研究糧油中揮發(fā)性成分也引起了廣泛興趣和重視［9］:張玉榮等［10］采用SPME技術對不同儲藏時間弱(強)筋小麥中的揮發(fā)性物質(zhì)進行提取、鑒定和分析;林家永等［11］采用頂空固相微萃取結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用技術對不同稻谷中的揮發(fā)性物質(zhì)進行分析。但這些分析方法僅僅只對SPME的萃取條件進行單因素的研究，并沒有進行系統(tǒng)優(yōu)化，因此本研究在單因素試驗的基礎上，采用響應面分析法進一步優(yōu)化秈稻中揮發(fā)性成分的SPME萃取條件，并采用SPME－GC－MS對儲藏期間秈稻谷所產(chǎn)生的揮發(fā)性成分進行分析，以期為確定秈稻谷在儲藏期間揮發(fā)性成分變化規(guī)律以及篩選特征標識物提供科學、客觀的分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料

晚秈稻:2011年入庫，浙江省嘉興糧庫提供。

1.2 主要儀器

手動SPME進樣器:南京大滬公司;GC(7890A)－MS(5975C)分析儀:美國Agilent公司;萃取頭(50/30 μm DVB/CAR/PDMS):美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 固相微萃取頭的老化

首次使用萃取頭時，插入GC－MS進樣口老化，老化時間120 min，老化溫度250℃;萃取頭每次使用前老化30 min，樣品與樣品之間老化5 min。

1.3.2 萃取

將20 g試樣置于頂空萃取瓶中，以錫紙作隔墊，用橡膠塞封口，混合均勻樣品后置于恒溫水浴鍋中加熱平衡，一段時間后，將固相微萃取頭插入瓶中萃取樣品揮發(fā)性成分，完畢后立即將萃取頭插入GCMS進樣口，在250℃不分流模式下解析。

1.3.3 GC－MS參數(shù)條件及分析

1.3.3.1 色譜條件

色譜柱為HP－5MS毛細管柱(30 m×0.25 mm，0.25μm);升溫程序為:起始柱溫50℃，保持5 min，以12℃/min上升到125℃，保持3 min，然后以1℃/min上升到165℃，保持3 min后以14℃/min上升到230℃，保持2 min，運行結(jié)束后冷卻2 min，溫度降為50℃。載氣為氦氣，流速為1 mL/min，不分流模式，進樣口溫度為250℃。

1.3.3.2 質(zhì)譜條件

離子源為EI，離子源溫度為230℃，電子能量為70 ev，質(zhì)量掃描范圍(m/z)為35～400 amu。

1.3.4 定性與定量分析

定性方法:未知揮發(fā)性成分經(jīng)計算機檢索與NIST08標準質(zhì)譜庫匹配得到，選擇匹配度大于80的揮發(fā)性組分進行分析。

定量方法:相對百分含量按峰面積歸一化計算。

1.3.5 試驗設計

1.3.5.1 單因素試驗

選取50/30μmDVB/CAR/PDMS規(guī)格的萃取頭，對萃取量、萃取溫度、平衡時間、萃取時間、解析時間5個因素進行試驗，分析各因素對離子色譜圖峰面積的影響。

1.3.5.2 響應面試驗

在單因素試驗基礎上，根據(jù)Box－Behnken Design方案的設計原理，以離子色譜圖峰面積為響應值，單因素試驗最佳值為中心點，進行四因素三水平的組合設計，最后通過響應面分析得到最佳萃取條件。

1.3.5.3 樣品檢測

根據(jù)響應面分析得到的最佳萃取條件對樣品進行檢測，并對結(jié)果進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 萃取條件的優(yōu)化

2.1.1 萃取量的選擇

選取50/30μmDVB/CAR/PDMS萃取頭，固定萃取溫度70℃，平衡時間60 min，萃取時間60 min，解析時間4 min，萃取量分別為10、15、20、25、30 g，考察萃取量對萃取效果的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 萃取量對萃取效果的影響

萃取量對萃取時間及效果影響很大［12］。萃取量越大，萃取頭吸附的物質(zhì)越多，總峰面積越大;但萃取量過多會導致堆積過厚，水浴平衡時受熱不均勻，物質(zhì)不能很好地揮發(fā)出來，同時萃取頭纖維吸附會出現(xiàn)飽和狀態(tài)，不利于更好地萃取物質(zhì)。由圖1可知，隨著萃取量的增加，總峰面積也隨之增大，當萃取量為20 g時，總峰面積達到最大，之后有所減小，說明萃取量存在最佳點，因此選擇20 g為最佳萃取量。

2.1.2 萃取溫度的選擇

選取50/30μmDVB/CAR/PDMS萃取頭，固定萃取量為20 g，平衡時間60 min，萃取時間60 min，解析時間4 min，萃取溫度分別為 50、60、70、80、90 ℃，考察萃取溫度對萃取效果的影響，結(jié)果如圖2所示。

頂空固相微萃取是比較敏感的樣品處理方法，萃取溫度對結(jié)果影響較大［6］。隨著溫度升高，氣體分子運動加快，有利于物質(zhì)更好地揮發(fā)出來，縮短達到吸附平衡的時間;但溫度過高又會使揮發(fā)性物質(zhì)與涂層之間的分配系數(shù)下降［13］，降低纖維頭的吸附量。由圖2可知，萃取溫度對總峰面積的影響效果顯著，萃取溫度為70℃時總峰面積達到最大，因此存在最佳值。

圖2 萃取溫度對萃取效果的影響

2.1.3 平衡時間和萃取時間的選擇

選擇50/30μmDVB/CAR/PDMS萃取頭，在萃取量20 g，萃取溫度70℃，萃取時間60 min，解析時間4 min 的條件下，平衡時間分別30、40、50、60、70 min，考察平衡時間對萃取效果的影響，結(jié)果如圖3所示。

平衡時間決定揮發(fā)性成分和樣品之間達到兩相平衡的效果，同時影響萃取纖維頭的吸附量和達到吸附平衡的時間［14］。由圖3可知，總峰面積隨著平衡時間的延長而增大，在60 min時達到最大值，隨后趨于平緩，存在最佳值。

選擇50/30μmDVB/CAR/PDMS萃取頭，在萃取量為20 g，萃取溫度70℃，平衡時間60 min，解析時間4 min的條件下，選擇萃取時間為 30、40、50、60、70 min，考察萃取時間對總峰面積的影響，結(jié)果如圖4所示。

固相微萃取的最佳萃取時間應該是揮發(fā)性成分在氣相和涂層兩相之間達到平衡的時間［13］，由圖4可知，隨著萃取時間的延長，總峰面積也隨之增大，在60 min時達到最大，存在最佳值，隨后開始減小，這是由于萃取頭纖維涂層吸附已經(jīng)飽和，萃取時間過長導致熱穩(wěn)定性低的物質(zhì)分解，因此總峰面積減小。

圖3 平衡時間對萃取效果的影響

圖4 萃取時間對萃取效果的影響

2.1.4 解析時間的選擇

選擇50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取頭，在萃取量20 g，平衡時間60 min，萃取溫度70℃，萃取時間60 min 的條件下，解析時間選擇 1、2、3、4、5 min，考察解析時間對萃取效果的影響，結(jié)果如圖5所示。

解析時間對萃取效果的影響表現(xiàn)為:若解析時間短，會導致物質(zhì)沒有完全解析出來;若解析時間過長，會使色譜峰變寬，保留時間發(fā)生變化［15］。由圖5可知，總峰面積隨著解析時間的延長而增大，4 min過后趨于平緩，總峰面積基本不變，考慮到解析時間長會影響萃取頭壽命，選擇4 min為最佳值。

圖5 解吸時間對萃取效果的影響

2.2 響應面法優(yōu)化萃取條件

2.2.1 響應面因素的確定及試驗方案

根據(jù) Box－ Behnken 試驗設計原理［16－17］，再綜合單因素試驗結(jié)果，選擇50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取頭，固定萃取量為20 g，以萃取溫度、平衡時間、萃取時間、解析時間為響應面因素，離子色譜總峰面積為響應值，進行四因素三水平的分析試驗，響應面因素和水平見表1。

表1 響應面分析試驗因素水平表

2.2.2 試驗設計及回歸分析

以離子色譜總峰面積為響應值進行響應面分析，試驗設計為24個析因點和5個零點，零點處重復5次以估計試驗誤差。試驗設計及結(jié)果見表2，回歸結(jié)果分析見表3。通過Design Expert軟件對表3中的結(jié)果進行二次回歸分析，得到如下多元二次響應面回歸模型:

表2 試驗設計和結(jié)果

Y=2.94+0.66A－0.051B+0.14C+0.14D+0.047AB+0.025AC－0.12AD－0.33BC－0.023BD－0.16CD－0.57A2－0.27B2－0.34C2－0.024D2

表3 回歸分析結(jié)果

回歸模型擬合度R2=0.900 3，表明試驗值與預測值具有較好的相關性，校正擬合度=0.800 7，表明該回歸模型可以解釋80.07%的響應值的變化，19.93%左右的變異不能由回歸模型來解釋;殘差為實際觀測值與回歸估計值之間的差，它的平方和反應了模型擬合程度，殘差越小，擬合程度越高，表3中殘差平方和為0.072，說明回歸模型擬合程度較高;同時信噪比(Adeq precision)為9.163(通常大于4模型較好)，進一步說明模型設計具有較好的擬合性。

由表3可以看出，BC、B2對結(jié)果影響較顯著(P＜0.05)，回歸模型及其顯著(P＜0.01)，表明擬合程度較好，此試驗具有很高的可信性和準確性;失擬項極其不顯著，說明試驗誤差較小;一次項中，A(萃取溫度)對結(jié)果的影響極其顯著(P＜0.01)，說明萃取溫度是影響離子色譜總峰面積的關鍵因素，二次項A2、C2對結(jié)果的影響也是極其顯著的。同時，從F值的大小可以判斷，4個因素對總峰面積影響程度的排序為A(萃取溫度)＞D(解析時間)＞C(萃取時間)＞B(平衡時間)。2.2.3 響應面曲面分析

圖6 萃取溫度、平衡時間、萃取時間、解析時間兩兩交互作用對萃取效果的影響

圖6 反應了萃取溫度、平衡時間、萃取時間、解析時間兩兩交互作用對響應值總峰面積的影響，圖6中可以看出，萃取溫度和解析時間對總峰面積的影響最大，表現(xiàn)為響應曲面較陡，這與方差分析的結(jié)果一致，并且隨著溫度升高，時間延長，響應值都是先升高后降低，說明存在極值點，根據(jù)萃取溫度和解析時間，萃取溫度和萃取時間，萃取時間和解析時間的響應曲面可看出對總峰面積影響最大的因素是萃取溫度，其次是解析時間，然后是萃取時間，最后是平衡時間，這符合表3中得出的方差分析結(jié)果，結(jié)合響應面分析圖和方差分析表得出最大響應值(Y)所對應的最佳的萃取條件為:萃取溫度74.69℃，平衡時間58.79 min，萃取時間60.48 min，解析時間為5 min，結(jié)合實際條件，選擇萃取溫度75℃，平衡時間59 min，萃取時間60 min，解析時間5 min。

2.3 樣品的檢測

按照最佳萃取條件，即萃取溫度75℃，平衡時間59 min，萃取時間60 min，解析時間5 min，對秈稻樣品的揮發(fā)性成分進行測定分析，得到樣品揮發(fā)性物質(zhì)總峰面積為3.203 6×109，與預測值3.181 3×109非常接近，相對誤差為0.69%，同時單因素試驗得到樣品揮發(fā)性物質(zhì)的總峰面積為2.940 0×109，小于最佳萃取條件下得到的數(shù)值，說明用響應面法優(yōu)化固相微萃取條件是更加合理可行的，同時共檢測出烴類、醛類、酮類、醇類、酸酯類、含氮含氯含氧及雜環(huán)化合物84種，其中烴類物質(zhì)含量最高，其次為醛類、含氮含氯含氧及雜環(huán)類、酸酯類、酮類、醇類。樣品峰譜圖如圖7所示，測得的揮發(fā)性成分及相對含量如表4所示。

圖7 秈稻的分析譜圖

表4 秈稻中各類揮發(fā)性成分及相對含量

表4 (續(xù))

表4 (續(xù))

3 結(jié)論

在單因素試驗的基礎上，將響應面分析法應用于固相微萃取條件，回歸分析模型顯著，試驗設計具有可行性，同時4個因素對響應值的影響不是簡單的線性關系，方差分析和響應曲面結(jié)果顯示，對總峰面積影響最大的2個因素為萃取溫度和解析時間，其次是萃取時間，最后是平衡時間，響應面法優(yōu)化固相微萃取稻谷揮發(fā)性成分的最佳處理條件為:萃取溫度75℃，平衡時間59 min，萃取時間60 min，解析時間5 min，在此條件下得到的總峰面積為3.203 6×109，與預測值的相對誤差為0.69%，共檢出烴類、醛類、酮類、醇類、酸酯類、化合物84種，其中烴類和醛類物質(zhì)含量最高、其次為含氮含氯含氧及雜環(huán)類、酸酯類、酮類、醇類。

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