王占偉，劉茂軍，王 麗，邵國青

（江蘇省農業(yè)科學院獸醫(yī)研究所農業(yè)部獸用生物制品工程技術重點實驗室國家獸用生物制品工程技術研究中心，江蘇 南京210014）

WANG Zhan-wei，LIU Mao-jun，WANG Li，SHAO Guo-qing

（Institute of Veterinary Medicine，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Veterinary Biological Engineering and Technology，Ministry of Agriculture/National Center for Engineering Research of Veterinary Bio-products，Nanjing 210014，China）

副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，Hps）是豬上呼吸道的一種常在菌，也被認為是一種條件性致病菌，即在特定條件下可以侵入機體并引起嚴重的全身性疾病，稱為格拉澤氏?。℅lasser′s disease），該病呈世界性分布，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重的損失，尤其是在近10 多年的時間里?；贙ieletein-Rapp-Gabriedson（KRG）瓊脂擴散血清分型方法[1]，將Hps分為15 個血清型，另有20%～40%分離株的血清型不可定。以血清流行病學調查為主的結果顯示，國外主要流行血清4、5 型和13 型Hps[2-3]，國內Hps 的流行情況與其型相似，以血清5 型和4 型為主，其次為血清12 型和13 型[4-5]。研究表明，毒力與血清型有一定關系，即血清1、5、10、12、13 型和14 型Hps的毒力最強，血清2、4 型和15 型Hps 的毒力次之，而血清3、6、7、8、9 型和11 型無毒力[6-7]。對于血清型較多的Hps，選擇一種合適的實驗動物作為攻毒模型，是進行防治研究的關鍵之一，目前，國內外使用的實驗動物有SPF豬[8]、剖腹產未吃初乳（CDCD）豬[9]、自然分娩未吃初乳（NFCD）豬[10]、人工助產未吃初乳（SFCD）豬[11]，但由于其對于試驗條件的要求和成本均較高，使得其應用于實際研究有局限性。因此，很多學者已探索用豚鼠和Balb/c 小鼠作為替代動物模型[12-14]。本文將以豚鼠和Balb/c 小鼠為攻毒模型，評價Hps 分離株FS0307 株、XX0306 株和標準株HS1079 株的致病力。

1 材料與方法

1.1 菌株 Hps 血清4 型分離株FS0307 株、血清5 型分離株XX0306 株，由本所分離保存；血清13型標準株HS1079 株，由北京市農林科學院惠贈。

1.2 動物 4 周齡的豚鼠、6 周齡Balb /c 小鼠，購自揚州大學實驗動物中心；自由采食和飲水。

1.3 材料 胰酶大豆瓊脂（TSA）和胰酶大豆肉湯（TSB）培養(yǎng)基（英國Oxioid 公司）；新生牛血清（蘭州民海）；NAD（國藥）；TSA、TSB 配制后添加10%新生牛血清和0.01% NAD。Hps 間接血凝（IHA）檢測試劑，本所制備。

1.4 菌株培養(yǎng) TSA 平板復蘇培養(yǎng)Hps 血清4 型分離株FS0307株、血清5型分離株XX0306株和血清13型標準株HS1079 株，挑取單菌落用TSB 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h 做為種子液，將種子液按培養(yǎng)基總體積的5%接種于TSB 液體培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)18 h，平板計數細菌；按所需濃度進行濃縮或稀釋。

1.5 Hps 對豚鼠的毒力 20 只豚鼠隨機分成4 組，其中，3 組攻毒組，每組5 只；1 組對照組，5 只。3 組攻毒組分別用Hps FS0307 株、XX0306 株和HS1079株通過腹腔接種，每只1 mL（5×109CFU）。對照組腹腔注射生理鹽水，每只1 mL。攻毒后每天觀察并記錄豚鼠的臨床表現和死亡情況，直到第10 天。對所有死亡和10 d 后未死亡豚鼠進行剖檢，觀察并記錄各組織器官的病變，同時無菌取腹腔液、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟進行細菌的分離，以確認Hps 的感染，并用Hps IHA 試劑檢測血清抗體。

1.6 Hps 對小鼠的毒力 取20 只Balb/c 小鼠，隨機分為4 組，3 組攻毒組和1 組對照組，每組5只。3 組攻毒組分別用Hps FS0307 株、XX0306 株和HS1079 株通過腹腔接種，每只0.5 mL（1×109CFU）。對照組腹腔注射生理鹽水，每只0.5 mL。感染后臨床觀察10 d，記錄小鼠的臨床表現和死亡情況，對死亡小鼠和10 d 后耐過的小鼠進行剖檢，觀察并記錄各組織器官的病變，無菌取腹腔液、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟接種TSA 平板進行Hps 再分離，并用Hps IHA 試劑檢測血清抗體。

2 結果

2.1 感染結果 Hps 感染豚鼠10 h 內，開始出現呼吸加快、精神沉郁、被毛粗亂等癥狀，且10 h 后開始死亡，若3 d 內未死亡的豚鼠，則耐過存活。連續(xù)觀察10 d 后的結果見表1。剖檢發(fā)現，死亡豚鼠均發(fā)現多臟器有出血。

表1 豚鼠感染結果

Hps 感染小鼠3 h 后，開始出現精神沉郁、厭食、震顫、背毛豎立、扎堆、不運動等臨床表現，且24 h 后開始死亡，若3 d 內未死亡的小鼠，則耐過存活。連續(xù)觀察10 d 后的結果見表2。剖檢發(fā)現，FS0307 株攻毒組和XX0306 株攻毒組死亡的1只小鼠的腹腔有輕微粘連。

表2 小鼠感染結果

2.2 Hps 再分離結果 無菌取所有死亡、存活豚鼠的腹腔液、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟進行分離Hps。結果顯示，FS0307 株攻毒組、XX0306 株攻毒組、HS1079 株攻毒組和對照組的實驗豚鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟等器官均未分離出Hps；而除了對照組和HS1079 株攻毒組存活的1 只豚鼠外，3組攻毒組豚鼠的腹腔液均分離到Hps。

無菌取各組死亡和存活小鼠的腹腔液、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟進行分離Hps。結果顯示，FS0307 株攻毒組、XX0306 株攻毒組、HS1079株攻毒組和對照組的實驗小鼠的腹腔液、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟等器官均未分離出Hps。

2.3 血清抗體的IHA 檢測結果 取各組死亡和未死亡的豚鼠、小鼠的血液，IHA 檢測血清抗體。結果顯示，Hps 感染的各組小鼠、豚鼠的血清抗體均為陰性。

3 分析與討論

Hps 一般出現在混合感染的病例中，因此學者們通常認為Hps 是某些疫?。ㄈ鏟CV2 感染、Mhp 感染或PRRSV 感染）的繼發(fā)病原，其原因是PCV2 或PRRSV 能誘導感染動物免疫抑制，為細菌的繼發(fā)創(chuàng)造條件[15-16]，因此單獨感染或者用普通豬來作實驗動物感染，成功的幾率很低。本文以豚鼠和Balb/c小鼠作為替代攻毒模型動物進行試驗，從臨床癥狀結果可知，Hps 血清4 型分離株FS0307 株、血清5 型分離株XX0306 株和血清13 型標準株HS1079 株均能引起小鼠和豚鼠100%發(fā)病，說明3 個血清型的菌株的毒力均較強，與Kielstein 等[1]和Oliveira 等[10]報道的基本一致；而且2 株分離菌株對豚鼠的致死率達到100%，對小鼠的致死率為20%；而標準株對豚鼠的致死率也達到80%，不致死小鼠，說明分離株的致病力強于標準株，且豚鼠對Hps 的敏感性強于小鼠。在選用何種動物作為攻毒模型動物時，動物的敏感程度是首先要考慮的，再結合實驗的穩(wěn)定性及其他因素綜合評價，從而確定模型動物。根據已有報道[13]，以及本試驗的結果，相比較而言，豚鼠更適合作為Hps 的攻毒模型動物。

在Hps 攻毒后進行再分離過程，由于死亡或者健活的小鼠和豚鼠均無腹腔液，故采用無菌生理鹽水沖洗腹腔的方法制備腹腔沖洗液，再用其進行分離和鑒定。分離結果說明，從小鼠和豚鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和存活動物的腹腔沖洗液不容易再次分離到Hps，這與賀云霞等[14]的結論基本一致，而與李雪松等[17]在小鼠肺臟、脾、心血中分離到Hps 的結果不一致。但在接種Hps 后很快死亡的豚鼠腹腔沖洗液中可分離到Hps，有可能是有部分活菌還存留在腹腔中。從Hps 感染各組小鼠、豚鼠的血清抗體均為陰性的結果，猜測有兩個因素：一是IHA 的敏感性較低；二是感染動物本身還未產生抗體或者產生的抗體效價還很低。

本研究以經典的實驗動物-豚鼠和Balb/c 小鼠為模型，評價了Hps 血清4 型分離株FS0307 株、血清5 型分離株XX0306 株和血清13 型標準株HS1079 株的毒力，這不僅為Hps 的攻毒模型提供了依據，也為副豬嗜血桿菌病疫苗的研究奠定了基礎。

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