袁彥波，趙樹臣，侯振中

（東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，黑龍江 哈爾濱150030）

棉酚是主要存在于棉花的葉、莖及種子中的一種有機物，是一種黃色結(jié)晶粉末，對人類和哺乳類有廣泛的毒性作用。同時，棉酚還具有抗生育作用，對雄性動物的影響比較明顯[1-2]，最早對棉酚的研究是用作男性的避孕藥。已有大量文獻報道棉酚及其衍生物能夠影響精子的生成、成熟、受精，甚至導致不可逆的無精作用，所以被禁止使用。很長一段時間內(nèi)棉酚都被認作是有毒廢物，但有關(guān)棉酚具體生殖毒性機理的研究尚未見有太多詳細的報道。20 d 灌服不同劑量的棉酚對雄性小鼠的生殖系統(tǒng)的的影響,為棉酚生殖毒性的研究提供實驗基礎(chǔ)，也為合理開發(fā)利用棉籽餅粕作為畜禽配合飼料及滅鼠提供科學參考。

1 材料

1.1 實驗動物 4 周齡清潔級雄性小鼠48 只，體重20±2 g，由東北農(nóng)業(yè)大學實驗動物中心提供。在室溫條件下常規(guī)飼養(yǎng)1 周，適應(yīng)環(huán)境，用于試驗。

1.2 主要試劑 棉酚，羧甲基纖維素鈉，均購自哈爾濱伊事達生物工程有限公司。石蠟、甲醛、PBS、伊紅、蘇木精、乙醇、二甲苯、中性樹膠等。

1.3 主要儀器 全自動石蠟切片機、全自動石蠟包埋機、恒溫箱、熔蠟箱、攤片烤片機、染色機。

2 試驗方法

2.1 分組 將48 只雄性小鼠隨機分為4 組，每組12 只，1 個對照組，3 個試驗組（30 mg/kg·d 組、60 mg/kg·d 組、240 mg/kg·d 組）。

2.2 稱重 每周和處死前分別用電子天平進行稱重并記錄。

2.3 動物染毒及取材 各組小鼠均于每天上午9 點對其進行灌胃染毒1 次，試驗組按30 mg/kg·d、60 mg/kg·d、240 mg/kg·d 劑量灌服由羧甲基纖維素鈉稀釋的棉酚0.4 mL，采用等體積不等濃度的方式，對照組僅灌服等體積的羧甲基纖維素鈉，連續(xù)灌胃20 d，第21 天稱重后處死小鼠，剖檢取出睪丸，稱其重量并計算臟器指數(shù)，并將睪丸置于4%多聚甲醛固定用于H.E.染色。

2.4 臨床癥狀觀察 灌胃后觀察小鼠活動情況，食物消耗情況。并分別在染毒第7、14、21 天稱量小鼠體重，觀察體重增長情況。

2.5 睪丸形態(tài)學觀察 將睪丸經(jīng)4%多聚甲醛固定24 h 后進行洗滌、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、蘇木精-伊紅染色、中性樹膠封片、加蓋玻片，放置恒溫箱中，于光學顯微鏡下觀察。

2.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。結(jié)果以X±s表示，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標準。P＜0.01為差異極顯著判斷標準。

3 結(jié)果

3.1 棉酚對小鼠臨床癥狀及體重的影響 灌服棉酚的小鼠，在服藥后出現(xiàn)厭食，飲食和飲水量明顯減少，活動能力減弱，出現(xiàn)被毛粗糙凌亂無光澤，高劑量組最為明顯，并且在給藥8 d 后出現(xiàn)死亡情況。中劑量組在給藥13 d 后出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，死亡小鼠剖檢后發(fā)現(xiàn)胃腸臌氣，有惡臭氣味，其他臟器無明顯眼觀變化。對照組與低劑量組均沒有出現(xiàn)死亡情況。體重變化情況見表1。

各組小鼠初始體質(zhì)量差異均不顯著（P＞0.05）。灌服棉酚后，試驗第1 周，各組小鼠體重均呈上升趨勢，體重差異都不顯著（P＞0.05）；第2周開始，高劑量組體重開始呈下降趨勢，體重差異顯著（P＜0.05），其他各組體重還呈上升趨勢，與初體重相比，對照組體重差異顯著（P＜0.05）；第3周中劑量組體重開始呈下降趨勢，高劑量組體重差異極顯著（P＜0.01）。低劑量組與對照組，體重仍處于上升趨勢。

表1 棉酚對雄性小鼠體重的影響 單位：g

3.2 棉酚對睪丸臟器指數(shù)的影響 與對照組相比，低劑量組睪丸臟器指數(shù)差異極顯著（P＜0.01）；中劑量組睪丸臟器指數(shù)差異顯著（P＜0.05）；高劑量組睪丸臟器指數(shù)差異不顯著（P＞0.05）。說明棉酚對雄性小鼠睪丸發(fā)育有抑制作用。見表2。

3.3 睪丸病理組織學觀察 對照組睪丸曲細精管固有結(jié)構(gòu)清晰完整，基膜與間質(zhì)之間界限清晰平整，間質(zhì)較少，生精細胞排列緊密，整齊有序，生精細胞無脫落、變性、壞死等異?，F(xiàn)象。與對照組相比，低劑量組睪丸結(jié)構(gòu)個別生精細胞排列較疏松，間隙變大，其他的基本沒變化；中劑量組生精上皮層數(shù)減少，間隙變大，曲細精管基膜有斷裂現(xiàn)象，部分生精細胞與支持細胞分離，個別曲細精管內(nèi)可見脫落的生精細胞，可見少量發(fā)育成熟的精子。高劑量組曲細精管形態(tài)不規(guī)則，邊緣不完整，甚至沒有曲細精管管腔，生精上皮變薄、層數(shù)減少，間隙增大。各級生精細胞腫大，排列紊亂并且伴隨有細胞缺失和細胞碎裂，出現(xiàn)大量生精細胞脫落到管腔，可見少量發(fā)育成熟的精子，甚至沒有發(fā)現(xiàn)成熟的精子（見圖1）。

圖1 不同劑量組病理組織學圖片

4 討論與小結(jié)

4.1 討論 本文試驗中，通過對4～5 周齡的雄性小鼠灌服不同劑量的棉酚，其體重、睪丸重及其臟器指數(shù)均有明顯下降，在一定程度上說明棉酚對小鼠生長發(fā)育有一定的影響。試驗結(jié)果顯示，棉酚對雄性小鼠體重組間差異有顯著性，灌服240 mg/kg·d 體質(zhì)量濃度棉酚的小鼠第5 天開始食欲不振、出現(xiàn)肚子臌氣、精神委靡等癥狀，消化機能出現(xiàn)紊亂現(xiàn)象，體重開始出現(xiàn)下降，第8 天開始小鼠有死亡現(xiàn)象，初步顯示了棉酚能夠?qū)е滦坌孕∈笾卸舅劳?。特別是對睪丸影響最大，表現(xiàn)為隨著劑量的加大，臟器系數(shù)下降，這與李根[3]等研究的結(jié)果相符。臟器指數(shù)是毒理學試驗中，反應(yīng)實驗動物對臟器損害靈敏而有效的指標[4]，可以很好的反映藥物對各個臟器的影響，尤其是反映毒性大小的重要指標。臟器指數(shù)增加表示臟器有充血、水腫、增生、肥大等變化，臟器指數(shù)下降表示臟器萎縮、退行性變化等[5]。H.E.染色結(jié)果顯示，低劑量與中劑量組睪丸組織曲細精管結(jié)構(gòu)及生精細胞有不同程度的損傷，高劑量組曲細精管形態(tài)不規(guī)則，邊緣不完整，內(nèi)緣排列很不規(guī)則，甚至沒有曲細精管管腔，生精上皮變薄、層數(shù)減少，間隙增大。有的生精小管管壁變得疏松且遭到破壞，各級生精細胞腫大，排列紊亂并且伴隨有細胞缺失和細胞碎裂，出現(xiàn)大量生精細胞脫落到管腔，可見少量發(fā)育成熟的精子，甚至沒有發(fā)現(xiàn)成熟的精子。結(jié)果與研究報道的棉酚對雄性睪丸生精細胞有破壞作用，可以造成生精上皮細胞凋亡，造成死精、少精，甚至無精子癥相一致[6-7]，表明，棉酚可以使鼠類不能生成成熟的精子，進而降低鼠類的繁殖能力。因此把棉酚應(yīng)用到滅鼠劑中，可有效解決鼠類的繁殖問題，降低鼠害的發(fā)生率[8]。棉酚可以引起小鼠食欲下降，生長很明顯受到抑制，體重下降。

4.2 小結(jié) 棉酚對雄性小鼠有一定的毒性作用，能使睪丸發(fā)生一定程度上的病理變化及能導致小鼠死亡，但對其機理還有待進一步的研究。

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