方志超，劉書(shū)超，林 雅，簡(jiǎn)燕娟，韓冠雙，呂朋沙，程方俊

（1.西南大學(xué)榮昌校區(qū)動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，重慶 榮昌402460 ；2.重慶交通大學(xué)，重慶 南岸400074；3.重慶市大足區(qū)農(nóng)委，重慶 大足402373）

四環(huán)素類(lèi)是一種廣譜抗菌藥物，主要通過(guò)阻止細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成而發(fā)揮抑菌甚至殺菌作用。動(dòng)物機(jī)體中共生大腸桿菌作為耐藥指示菌和四環(huán)素耐藥基因的貯存庫(kù)，在致病性菌株耐藥性的預(yù)測(cè)及耐藥基因的傳遞方面起著非常重要的作用，因此調(diào)查致病性大腸桿菌對(duì)四環(huán)素類(lèi)抗生素的耐藥性和耐藥機(jī)制對(duì)人類(lèi)和動(dòng)物臨床疾病的防控具有重要意義。

目前，對(duì)于大腸桿菌耐藥性的研究很多[1-3]，但是，對(duì)于重慶地區(qū)鴨源致病性大腸桿菌對(duì)四環(huán)素類(lèi)藥物耐藥性的研究資料較少，基于此，本試驗(yàn)采用PCR 技術(shù)對(duì)重慶地區(qū)鴨源致病性大腸桿菌四環(huán)素耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)，以了解重慶地區(qū)大腸桿菌對(duì)四環(huán)素耐藥差異以及主要耐藥基因的分布情況，這對(duì)重慶地區(qū)鴨大腸桿菌病提供藥物治療及預(yù)防具有重要的臨床指導(dǎo)價(jià)值。

1 試驗(yàn)材料

1.1 菌株 西南大學(xué)榮昌校區(qū)預(yù)防獸醫(yī)教研室2005-2011 年在重慶地區(qū)分離鑒定并保存的致病性大腸桿菌40 株。

1.2 藥品與試劑 常規(guī)質(zhì)粒提取試劑盒E.Z.N.A.Plasmid Mini Kit I、Gold-view 染色劑、PCR 產(chǎn)物凝膠回收試劑盒均購(gòu)自廣州飛揚(yáng)生物工程有限公司；Premix Ex Taq 購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

2 耐藥基因的檢測(cè)

用PCR 方法擴(kuò)增耐藥基因，按照GenBank 公布的tet 基因序列，參考相關(guān)文獻(xiàn)[4-7]設(shè)計(jì)引物（表1）。

按照常規(guī)質(zhì)粒提取試劑盒的說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格提取大腸桿菌的質(zhì)粒并作為模板。

表1 PC R 擴(kuò)增4環(huán)素耐藥基因引物的序列

PCR 擴(kuò)增全部采用25 μL 體系，如表2。tetA、

表2 PC R 擴(kuò)增反應(yīng)體系

tetB、tetC 基因PCR 反應(yīng)條件如表3。tetD、tetK、

表3 tetA 、tetB、tetC 基因PC R 反應(yīng)條件

tetL 基因PCR 反應(yīng)條件如表4。

表4 tetD、tetK 、tetL 基因PC R 反應(yīng)條件

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 主動(dòng)外排機(jī)制耐藥基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果 四環(huán)素類(lèi)耐藥基因tetA、tetB、tetC、tetD 基因的PCR擴(kuò)增凝膠電泳圖，如圖1-3 所示，擴(kuò)增產(chǎn)物與目的片段基因大小相符，tetA 為210 bp、tetB 為659 bp、tetC 為418 bp、tetD 為260 bp，未檢測(cè)出tetK、tetL 耐藥基因。

圖1～1 tetA 、tetB 基因電泳

圖1～2 tetC 基因電泳

圖1～3 tetD 基因電泳

3.2 主動(dòng)外排機(jī)制耐藥基因檢測(cè)結(jié)果 在40 株大腸桿菌中，tetB、tetA、tetC 和tetD 基因的檢出率分別為80.0%、75.0%、55.0%和15.0%。其中攜帶tetB 基因的菌株在所有檢測(cè)基因中陽(yáng)性率最大。在本次試驗(yàn)中，部分菌株同時(shí)含有兩種以上

4 討論

耐四環(huán)素基因tet 的分布存在多樣性，不同地域、不同宿主及不同細(xì)菌都會(huì)表現(xiàn)出tet 基因的多樣性。Voskresenskii A M等[8]用32P放射性標(biāo)記探針對(duì)44株志賀氏菌檢查，發(fā)現(xiàn)含有tetA的基因占66%，50 株沙門(mén)菌中含tetC 基因的占到20%。王曉泉[9]用PCR 方法檢測(cè)四環(huán)素耐藥基因在84 株雞源沙門(mén)菌分離菌株中的分布情況。結(jié)果顯示，雞白痢和雞傷寒沙門(mén)菌只攜帶tetA 基因。張純萍等[10]對(duì)健康雞、豬體內(nèi)分離出的269 株大腸桿菌進(jìn)行檢測(cè)四環(huán)素類(lèi)耐藥基因，tetA、tetB、tetM 的攜帶比例為87.9%、28.4%、15.5%。

Chiayzn Lee 等[11]報(bào)道，腸道菌中tetB 最普遍，對(duì)3 個(gè)不同豬場(chǎng)糞便中分離的114 株革蘭陰性菌進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果tetB 的檢出率為35%，此外，在預(yù)防和治療的選擇性壓力下，tetB 更普遍。

本試驗(yàn)中，tetB 的檢出率最高，為80%，在所有檢測(cè)基因中陽(yáng)性率最大。tetA 的檢出率為75%，而且所有菌株均可檢測(cè)到tetA 或tetB 基因，部分菌株還同時(shí)含有兩種以上主動(dòng)外排機(jī)制的基因，這種情況的出現(xiàn)可能與攜帶耐四環(huán)素基因的轉(zhuǎn)座子、接合轉(zhuǎn)座子或者質(zhì)粒在細(xì)菌間的傳遞有關(guān)。此結(jié)果與Chiayzn Lee 報(bào)道結(jié)果相似。本試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明：tetA 和tetB 廣泛存在于重慶地區(qū)鴨源大腸桿菌，是該地區(qū)鴨源大腸桿菌對(duì)耐四環(huán)素類(lèi)藥物的主要耐藥機(jī)制，這與張純萍、王曉泉等人報(bào)道有所差異，可能是由于宿主不同，環(huán)境不同，用藥情況不同，不同地區(qū)的菌株存在tet 多樣性。tetC 的檢出率為55.0%，據(jù)報(bào)道[12]，tetC 不是大腸桿菌攜帶的主要四環(huán)素耐藥基因，而本結(jié)果檢出率很高，說(shuō)明tetC 的耐藥基因近年來(lái)，也在重慶地區(qū)鴨源大腸桿菌內(nèi)廣泛存在，應(yīng)引起重視。本試驗(yàn)未檢測(cè)出tetK、tetL 基因，該類(lèi)基因主要存在于革蘭陽(yáng)性菌中，革蘭陰性菌中很少見(jiàn)。

[1] 樊國(guó)燕，臧金燦，邊傳周.規(guī)模化豬場(chǎng)大腸桿菌的分離鑒定及耐藥性監(jiān)測(cè)[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008（3）：110-112．

[2] Yang H C，Chen S，White D G，et al.Characterization of multipleantimicrobial- resistant Escherichia coli isolates from diseased chickens and swine in China[J].Journal of Clinical Microbiology，2004，42（8）：3483-3489.

[3] 郝智慧，肖希龍，邱梅，等.不同區(qū)域雞大腸桿菌對(duì)抗菌藥的耐藥性比較[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2009，39（1）：84-88．

[4] Aminov R I，Garrigues-Jeanjean N，Mackie R I.et al.Molecular ecology of tetracycline resistance：development and validation of primers for detection of tetracycline resistance genes encoding ribosomal protection proteins[J].Applied and Environmental Microbiology，2001，67（1）：22-32．

[5] Sengelov G，Halling-Sorensen B，Aarestrup F M.Susceptibility of Escherichia coli and Enterococcus faecium isolated from pigs and broiler chickens to tetracycline degradation products and distribution of tetracycline resistance determinants in E.coli from food animals[J].Veterinary Microbiology，2003，95（1-2）：91-101.

[6] Giovanetti E，Brenciani A，Lupidi R，et al.Presence of the tet(O)gene in erythromycin-and tetracycline-resistant strains of Streptococcus pyogenes and linkage with either the mef（A）or the erm（A）gene[J].Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2003，47（9）：2844-2849.

[7] Noemi Aniko Bartha，jozsef Soki，Edit Urban.Investigation of the prevalence of tetQ，tetX and tetX1 genes in Bacteroides strains with elevated tigecycline minimum inhibitory concentrations[J].International Journal of Antimicrobial Agents，2011，38：522-525．

[8] Voskresenskii A M，Belokhvostov A S，SidorenkoS V，et al.Detection of the Determinants of Tetracycline A，B and C Resistance in Shigella and Salmonella Using DNA Probes[J].Antibiotic K-himioter，1991，p.17-19，V01.36，No.7．

[9] 王曉泉，王彥紅，吳雙，等.四環(huán)素耐藥基因在雞源沙門(mén)茵中的分布和傳播[J].中國(guó)家禽，2007 29（9）：10-12．

[10] 張純萍，寧宜寶，宋立.健康雞豬體內(nèi)大腸桿菌對(duì)四環(huán)素的耐藥性及耐藥基因分布[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，43（12）：2578-2583．

[11] Chiayzn Lee，Bruce E，LangLois，et al.Detection of Tetracycline Resistance Determinants in Pig Isolates from Tree Herds with Different Histories of Antimicrobial Agents Exposure[J].Applied and Environmental Microbiology，1993，p.1467-1472，Vol.59，No.5．

[12] 代敏，王雄清，殷桂蘭.四環(huán)素耐藥基因的生化和遺傳機(jī)制研究進(jìn)展[J].綿陽(yáng)師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，25（1）：72-78．