郭金玉，張鶴曉，高志強(qiáng)，林祥超，臧京帥，王麒文，牛建蕊，張樂(lè)萃

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東 青島266109 ；2.北京出入境檢驗(yàn)檢疫局，北京 朝陽(yáng)100026；3.北京森康生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司，北京 懷柔101400）

水皰性口炎（vesicular stomatitis,VS）是由水皰性口炎病毒（VSV）所引起的、人畜共患的高度接觸性傳染病[1]。VSV有囊膜、是單股、負(fù)鏈不分節(jié)段的RNA病毒，屬于彈狀病毒科水皰性病毒屬的成員，也被稱為偽口蹄疫。VSV 主要分為兩個(gè)血清型，其代表株分別為印第安納株（VSV-IND）和新澤西株（VSVNJ）[2]。馬、牛和多種動(dòng)物都可發(fā)生感染，臨床以蹄和口部產(chǎn)生水皰性損傷和潰爛為特征，引起動(dòng)物產(chǎn)奶量、產(chǎn)肉量下降，對(duì)畜牧業(yè)的發(fā)展構(gòu)成了極大的威脅。也可偶發(fā)于人，感染后出現(xiàn)急性熱，類似流感和登革熱的癥狀[3]，嚴(yán)重影響人類的衛(wèi)生健康。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為申報(bào)的傳染病，但在我國(guó)進(jìn)出境動(dòng)物檢疫對(duì)象中被列為二類病，屬于外來(lái)病。在美國(guó)東南部的一些州如新墨西哥、亞利桑那、猶他州和科羅拉多州大約每隔10 年散在發(fā)生VS[4]。2004 年到2007 年美國(guó)西南部的9 個(gè)州發(fā)生751 起新澤西血清型的VS 疫情,給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失[5]。

在VSV 流行的地區(qū),動(dòng)物體內(nèi)抗VSV-IND 抗體一般表現(xiàn)陽(yáng)性, 但臨床病例卻多由VSV-NJ 引起[2]。目前，檢測(cè)VSV-NJ 的補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)和病毒中和試驗(yàn)方法比較復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)。因此，本試驗(yàn)擬建立間接ELISA 快速有效的檢測(cè)VSV-NJ 抗體，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)診斷試劑盒奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 HRP 標(biāo)記的rec Protein G、IPTG（異丙基-β-D 硫代半乳糖苷）、TMB、CBS（碳酸鹽緩沖液），由本實(shí)驗(yàn)室配制。

85-2 數(shù)顯恒溫磁力攪拌器、紫外分光光度計(jì)（Amersh am Biosciences 公司）；酶標(biāo)儀（BIO-RAD公司）；3K15 高速低溫離心機(jī)（Sigma 公司）；紫外凝膠成像儀（BIO-RAD 公司）；洗板機(jī)（BIO-RAD公司）。

1.2 重組質(zhì)粒、宿主菌及血清 表達(dá)載體pET-32a-NJ-G666 由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保存；大腸桿菌（E.coli）Rosetta、出口馬陰性血清，本實(shí)驗(yàn)室保存；VSV-NJ 陽(yáng)性血清，用VSV-NJ 滅活病毒免疫陰性馬制備。

1.3 水皰性口炎病毒糖蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至Rosetta 宿主菌，挑取單菌落進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)后，次日按1∶100 的比例把重組表達(dá)菌株接種氨芐抗性LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600nm 值為0.6 左右，加IPTG 進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。分別對(duì)表達(dá)后的上清、沉淀進(jìn)行SDS- PAGE檢測(cè)，顯示目的蛋白為包涵體。

1.4 包涵體的洗滌與溶解 用含低濃度尿素的Tris緩沖液洗滌包涵體，除去包涵體上粘附的雜質(zhì)。最后用含高濃度尿素的Tris 緩沖液溶解包涵體。

1.5 包涵體的純化與復(fù)性 將包涵體蛋白用His·Bind 試劑盒進(jìn)行親和層析純化。

蛋白純化后裝于透析袋內(nèi)，放置4 ℃透析復(fù)性。復(fù)性液梯度依次用含6、4、2、0 mol/L 的尿素Tris 緩沖液，每次透析時(shí)間為12 h。用PEG 對(duì)蛋白溶液進(jìn)行濃縮，離心后收集上清進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)。

1.6 VSV-NJ 型間接ELISA 檢測(cè)方法的建立

1.6.1 間接ELISA 最佳反應(yīng)條件的確定

1.6.1.1 抗原和血清工作濃度的確定 在96 孔ELISA 反應(yīng)板上使用棋盤滴定的方法測(cè)抗原和血清的最佳工作濃度。

1.6.1.2 酶標(biāo)蛋白G 最佳工作濃度的測(cè)定 將酶標(biāo)抗體作1∶2 000、1∶1 000、1∶500 稀釋，抗原和血清按最佳稀釋度稀釋，測(cè)其OD450nm 值。

1.6.1.3 封閉液和封閉時(shí)間的確定 封閉時(shí)分別用PBST 稀釋的5%脫脂奶粉、1%BSA、1%卵清蛋白封閉2 h，據(jù)其OD450nm值顯示，含1%BSA 的PBST 封閉效果較好。然后用pH9.6 碳酸鹽緩沖液（CBS）稀釋的1%BSA放置4 ℃封閉24 h、放置37 ℃封閉24 h（需在濕盒中進(jìn)行），比較封閉效果。

1.6.2 間接ELISA 方法陰陽(yáng)性的判斷 用抗原最佳包被濃度包被酶標(biāo)板，檢測(cè)30 份陰性出口馬血清，以測(cè)出的OD450nm 平均值（-X）+3 標(biāo)準(zhǔn)差（SD）作為判定陰陽(yáng)性血清的臨界值。

1.6.3 特異性試驗(yàn) 間接ELISA 方法檢測(cè)東部馬腦脊髓炎、馬西尼羅病毒的陽(yáng)性血清、印第安納型水皰性口炎陽(yáng)性血清，并用新澤西型水皰性口炎的陽(yáng)性血清作為對(duì)照做特異性試驗(yàn)。

1.6.4 重復(fù)性試驗(yàn) 選取4 份不同的水皰性口炎病毒的血清樣品，使用同一酶標(biāo)板，檢測(cè)板內(nèi)重復(fù)性；使用不同酶標(biāo)板檢測(cè)板間重復(fù)性。用酶標(biāo)儀測(cè)OD450nm，分別計(jì)算兩者的變異系數(shù)（CV%）。1.7 間接ELISA 測(cè)血清效價(jià)與中和試驗(yàn)結(jié)果分析比較

1.7.1 VSV-NJ 病毒的制備及TCID50的測(cè)定 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的marc145（猴胚胎腎上皮細(xì)胞）傾去培養(yǎng)基，接種1∶100 稀釋的VSV-NJ 型病毒0.5 mL，37 ℃吸附1 h 后補(bǔ)維持液到5 mL，在37 ℃、5% CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)并持續(xù)觀察。待大部分細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變時(shí)，反復(fù)凍融3 次后收集培養(yǎng)液，用Reed-Muench 法測(cè)定該病毒的TCID50。

1.7.2 血清中和效價(jià)的測(cè)定 將待檢的38 份血清于56 ℃水浴中滅活30 min 后，在96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板板內(nèi)用稀釋液從1∶2 倍比稀釋至1∶256，加入50 μL 工作濃度為100 TCID50病毒液，37 ℃中和1 h 后加處理好的細(xì)胞50 μL，并做正常細(xì)胞對(duì)照、陰陽(yáng)性對(duì)照和病毒回歸試驗(yàn)。病毒回歸試驗(yàn)做4個(gè) 滴 度 分 別 為100TCID50、10TCID50、1TCID50、0.1 TCID50，每個(gè)滴度重復(fù)4 孔。

1.7.3 間接ELISA 測(cè)血清效價(jià) 按照建立的間接ELISA 方法，將同樣的38 份血清以1∶20、1∶40，依次作倍比系列稀釋，測(cè)定血清的ELISA 效價(jià)。

1.7.4 兩種方法的分析比較 將38 份血清的中和效價(jià)結(jié)果與ELISA 效價(jià)相比較，探索其相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 水皰性口炎糖蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及優(yōu)化 經(jīng)測(cè)試，確定水皰性口炎糖蛋白的最佳誘導(dǎo)達(dá)條件為：將菌液按比例加入含氨芐抗性的LB 后放于37 ℃培養(yǎng)，當(dāng)OD600nm 值達(dá)0.6 左右，加入終濃度為0.6 mmol/L 的IPTG 在30 ℃誘導(dǎo)4 h，電泳結(jié)果顯示，在30 kDa 處出現(xiàn)包涵體蛋白（圖1）。

圖1 S D S -PA G E 分析

2.2 包涵體的洗滌與溶解 洗滌后的包涵體蛋白在含6 mol/L 的尿素Tris 緩沖液中溶解，少部分溶于8 mol/L 尿素中。

2.3 包涵體的純化與復(fù)性 將包涵體蛋白用His·Bind 試劑盒純化后，得到較純的重組蛋白（圖2）。免疫印跡表明重組蛋白有良好的反應(yīng)原性。

圖2 重組蛋白純化結(jié)果

2.4 間接ELISA 方法的建立

2.4.1 間接ELISA 最佳反應(yīng)條件的確定

2.4.1.1 抗原和血清工作濃度的確定 經(jīng)摸索優(yōu)化試驗(yàn)條件，確定抗原最佳包被濃度為0.56 μg/mL，在37 ℃1 h 后4 ℃包被過(guò)夜、血清最佳工作濃度為1∶40 時(shí)效果最好。

2.4.1.2 酶標(biāo)蛋白G 最佳工作濃度的測(cè)定 經(jīng)間接ELISA 測(cè)定，酶標(biāo)蛋白G 做1∶500 稀釋時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照OD450nm 值與陰性對(duì)照OD450nm（P/N）值之比較大。

2.4.1.3 封閉液和封閉時(shí)間的選擇 按照已優(yōu)化好的條件進(jìn)行間接ELISA 檢測(cè)，重復(fù)3 次，通過(guò)比較封閉效果，可看出封閉液用pH 9.6 CBS 稀釋的1% BSA 37℃封閉24 h（需在濕盒中進(jìn)行），封閉效果最好。封閉結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 封閉液和封閉時(shí)間的選擇

2.5.1 間接ELISA 方法陰陽(yáng)性的判斷結(jié)果 經(jīng)計(jì)算得出，30 份陰性出口馬血清OD450nm 值的=0.16，SD=0.047。臨界值為0.301。血清檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 30份陰性血清O D 450nm值

2.5.2 特異性試驗(yàn) 間接ELISA 檢測(cè)結(jié)果顯示，重組蛋白與VSV-NJ 陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，與其他血清不存在特異性反應(yīng)（表2）。

表2 特異性試驗(yàn)

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 對(duì)4 份血清樣品進(jìn)行間接ELISA 檢測(cè)，結(jié)果顯示OD450nm 值的板內(nèi)變異系數(shù)（CV%）最大為5.64%，板間變異系數(shù)（CV%）最大為7.60%，均小于10%。表明建立的間接ELISA 方法具有良好的重復(fù)性。

2.6 間接ELISA 測(cè)血清效價(jià)與中和試驗(yàn)結(jié)果分析比較。

2.6.1 VSV-NJ 病毒的TCID50的測(cè)定 對(duì)制備的VSV-NJ 型病毒進(jìn)行TCID50測(cè)定，該批病毒TCID50為10-5.34/0.05 mL。

2.6.2 兩種方法測(cè)血清效價(jià)及分析比較 中和試驗(yàn)結(jié)果顯示，病毒回歸試驗(yàn)成立，正常對(duì)照細(xì)胞生長(zhǎng)良好。38 份血清中，病毒中和試驗(yàn)檢測(cè)31 份為陰性，7 份陽(yáng)性。間接ELISA 檢測(cè)結(jié)果與中和試驗(yàn)相符。其中，7 份陽(yáng)性血清的中和效價(jià)和ELISA 效價(jià)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 VS V-ELIS A 效價(jià)和中和抗體效價(jià)的比較

中和試驗(yàn)和間接ELISA 共同檢測(cè)38 份馬血清，通過(guò)結(jié)果可以看出，這兩種方法檢測(cè)血清樣品的陰陽(yáng)性一致。

3 討論

VSV 基因結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，是重要的模型病毒，被廣泛用于囊膜病毒的入侵、裝配以及釋放等諸多方面的研究[6]。本試驗(yàn)在大腸桿菌中表達(dá)的重組蛋白為非分泌型蛋白，它以包涵體的形式聚集在胞漿內(nèi)。通過(guò)對(duì)包涵體進(jìn)行純化和復(fù)性后包被96孔酶標(biāo)板，建立了一種間接ELISA 方法用于VSVNJ 抗體的檢測(cè)。試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法具有良好的特異性和重復(fù)性，為水皰性口炎的血清學(xué)診斷提供了一種操作簡(jiǎn)便、快速有效的方法。。

本試驗(yàn)建立的間接ELISA 方法在選用封閉液時(shí)，結(jié)果顯示，用PBST 稀釋的1% BSA 封閉2 h 效果較好，陽(yáng)性血清OD450nm 值為1.02、陰性為0.18左右。通過(guò)對(duì)封閉液進(jìn)一步探索發(fā)現(xiàn)，用pH9.6碳酸鹽緩沖液稀釋的1% BSA 放置4 ℃和37 ℃封閉24 h 后，陽(yáng)性血清OD450nm 值分別上升到1.5、3.0 左右，而其陰性值均無(wú)明顯變化。原因可能有兩點(diǎn)：在間接ELISA 中，抗體跟目的蛋白的結(jié)合是非常特異的，結(jié)合能力很強(qiáng)，而封閉則是用無(wú)關(guān)的蛋白質(zhì)填充酶標(biāo)板上未結(jié)合抗原的部位，從而排斥在ELISA 其后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附，顯著降低非特異反應(yīng)的發(fā)生，讓抗體的特異性結(jié)合更加充分，使陽(yáng)性信號(hào)變強(qiáng)，這就是封閉時(shí)間延長(zhǎng)陽(yáng)性信號(hào)變強(qiáng)的一個(gè)原因；還有一個(gè)原因跟蛋白的性質(zhì)有關(guān)，在本試驗(yàn)中封閉時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，使VSV-NJ 糖蛋白的活性升高，因此陽(yáng)性值升高。通過(guò)和其他蛋白進(jìn)行比較，這種封閉方法并不能使其他蛋白的陽(yáng)性值發(fā)生明顯變化，也就是不能使其他蛋白的活性升高，只適用于VSV-NJ 糖蛋白。

間接ELISA 通過(guò)和中和試驗(yàn)結(jié)果分析比較，兩者在檢測(cè)血清的陰、陽(yáng)性上沒(méi)有差別。并且間接ELISA 用時(shí)更短，操作上也比較簡(jiǎn)單，其結(jié)果具有高度的可靠性。

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[2] 溫志遠(yuǎn)，葛金英，胡森，等.表達(dá)增強(qiáng)綠色熒光蛋白重組水皰性口炎病毒印第安納株的構(gòu)建[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2007，12.

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