李曉云，李 巍，伊娜娜，張子群，劉 兵，初純明，宋銘忻

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150030 ；2.黑龍江出入境檢驗檢疫局，黑龍江 哈爾濱150001）

單增李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）是一種重要的人獸共患食源性病原菌，包括人類在內(nèi)的40 多種哺乳動物、20 多種飛禽類和部分水生動物均可分離到該菌，可引起人和動物的腦膜炎、胃腸炎、慢性肝炎、敗血癥及死胎、流產(chǎn)等，也有研究表明，感染該菌偶爾可引起皮膚組織的損傷和流行性感冒樣癥狀[1-2]。人類感染率雖然不高，但是感染后很容易發(fā)病，平均致死率達(dá)20%～30%[3]，在免疫功能缺陷者以及新生兒、孕婦、老年人等免疫力低下人群中更高達(dá)70%[4]。不同來源的菌株致病性差異較大，有些菌株致病性很強，而另一些菌株毒力較弱甚至無致病性[5]。為研究不同毒力單增李斯特菌對機體的致病性差異以及機體對不同毒力菌株的免疫應(yīng)答差異，選取毒力差異顯著的兩株LM（菌株LMo 0586 和LM N21），通過建立不同毒力及菌量的小鼠感染模型（A 組：低劑量攻弱毒、B 組：半數(shù)致死量攻弱毒、C 組：半數(shù)致死量攻強毒、D 組：過量攻強毒），觀察LM 在小鼠體內(nèi)的動態(tài)分布情況、小鼠機體組織病理學(xué)變化并對血清中重要炎性因子IL-12、TNF-α、INF-γ進(jìn)行動態(tài)觀察，為研究單增李斯特菌致病機制及開發(fā)新型疫苗載體等工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種與實驗動物 菌株LM N21 為本實驗室保存，菌株LMo 0586 為東北農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實驗室李一經(jīng)教授惠贈。本實驗室已完成兩株菌的半數(shù)致死量（LD50）測定，LMo 0586 的LD50為105.5、LM N21 的LD50為108.2，兩菌株毒力差異顯著，LM N21為弱毒株，LMo 0586 為強毒株。實驗動物為5 周齡雌性清潔級昆明系小鼠（體重20 g 左右），購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院實驗動物中心。

1.2 培養(yǎng)基及主要試劑 李斯特菌培養(yǎng)基TSBY 和增菌液按照《GB 4789.30-2010 食品微生物學(xué)檢驗方法》配制。rTaq 聚合酶、dNTP Mixture、酵母提取物、胰蛋白胨，均購自大連寶生物工程有限公司；細(xì)胞因子ELISA 試劑盒，購自RD 公司。

1.3 小鼠感染及分組 兩株不同毒力李斯特菌分別培養(yǎng)，收集菌體并計數(shù)，根據(jù)菌株的半數(shù)致死量（LD50），用PBS 緩沖液調(diào)整菌體濃度為105.5CFU/mL和108.2CFU/mL，將小鼠分成4 組（A 組～D 組，40 只/組）進(jìn)行腹腔注射，每鼠注射0.2 mL 菌液。A組：105.5CFU/mL 的弱毒株LM N21；B 組：108.2CFU/mL 的弱毒株LM N21；C 組：105.5CFU/mL 的強毒株LMo 0586；D組：108.2CFU/mL 的強毒株LMo 0586。同時設(shè)對照組若干，腹腔注射生理鹽水，對照組和試驗組的全部小鼠在相同條件下喂飼。

1.4 LM 在感染鼠體內(nèi)的動態(tài)分布檢測 細(xì)菌感染后，于2、4、6、8、12 h、1 d、2 d，從各組中隨機取出3只小鼠，斷頸處死，無菌條件下剖取心臟、腦，分別勻漿，將勻漿液抽至EB 增菌液中，37 ℃培養(yǎng)48 h。對培養(yǎng)物進(jìn)行PCR 檢測，引物參照Deneer 等設(shè)計的特異性引物[6]（主要擴增保守的hlyA 基因片段），擴增片段長度為743 bp，PCR 產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，出現(xiàn)743 bp 特異性條帶為陽性。

1.5 LM 感染鼠肝臟及腦組織病理學(xué)觀察 取感染后12 h、1 d 的小鼠肝組織以及感染1 d 的腦組織制作石蠟切片，以常規(guī)方法進(jìn)行H.E.染色，觀察小鼠肝臟及腦組織的病理學(xué)變化。

1.6 小鼠血清重要炎性因子動態(tài)變化檢測 于4、8、12 h、1、2、3、5 d 和7 d，從各組中隨機取出3只小鼠，眼球采血，5 000 r/min 離心取血清，使用ELISA 試劑盒檢測各組血清中IL-12、TNF-α、INF-γ細(xì)胞因子的表達(dá)量，按照試劑盒使用說明書進(jìn)行操作，用酶標(biāo)儀測定吸光度（OD）值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中各因子含量。

2 結(jié)果

2.1 單增李斯特菌在感染鼠心臟和腦中的動態(tài)分布 4 組小鼠均于不同時期在心臟、腦中檢出LM，結(jié)果見表1。感染后2 h，C、D 兩組小鼠心臟中就可檢出LM，感染后4 h，這兩組全部小鼠心臟均檢出細(xì)菌，此時A、B 兩組還各有1 只小鼠未檢出細(xì)菌。感染后6 h，D 組的1 只小鼠腦中檢出LM，至感染后8 h，C、D 兩組各有兩只小鼠在腦中檢出細(xì)菌，此時A、B 兩組各有1 只小鼠腦中檢出細(xì)菌，至感染后2 d僅有1 只小鼠（A 組）未在腦中檢出細(xì)菌。

2.2 感染LM 小鼠狀態(tài)及剖檢、組織病理變化 感染后4 組小鼠均出現(xiàn)了不同程度的病態(tài)變化：A 組小鼠感染后1 d，部分小鼠出現(xiàn)精神委靡、食欲減少、皮毛無光澤等癥狀，感染后2 d 表現(xiàn)出癥狀的小鼠數(shù)量增多，5 d 后，癥狀逐漸減輕至恢復(fù)健康狀態(tài)，試驗期間內(nèi)無小鼠死亡。在2 h～6 h 內(nèi)，各臟器無明顯病理變化，8 h 剖檢的3 只小鼠中有1 只小鼠脾臟稍有水腫，12 h 剖檢的小鼠可見肝臟腫大的病理變化，試驗期間小鼠腦部未見明顯的病理變化。B組小鼠感染后1 d，大部分小鼠除了出現(xiàn)與A組相似的患病癥狀外，還出現(xiàn)了抽搐、點頭、繞圈等神經(jīng)癥狀，5 d 后癥狀緩解，感染后2 d 開始有小鼠陸續(xù)死亡，至試驗結(jié)束除正常處死的小鼠外共死亡5 只。6 h 出現(xiàn)脾臟腫大，8 h 有2 只小鼠出現(xiàn)肝臟腫大的癥狀，2 d 時1 只小鼠腦組織出現(xiàn)水腫、出血。C 組小鼠與B組小鼠癥狀類似，感染1 d有1只老鼠死亡，至試驗結(jié)束除正常處死的小鼠外共死亡7 只。1 d時即有小鼠腦組織出現(xiàn)病理變化。D組小鼠感染后12 h，就有部分小鼠出現(xiàn)了患病癥狀，感染后1 d，小鼠開始陸續(xù)死亡，到第5 天，包括正常處死在內(nèi)的40只小鼠全部死亡。

顯著組織病理變化如圖1。感染后12 h，A 組小鼠肝細(xì)胞無明顯病理變化，B、C、D 組小鼠可見不同程度的肝細(xì)胞損傷，部分靜脈細(xì)胞脫落進(jìn)入管腔；感染后1 d，A 組小鼠肝細(xì)胞也出現(xiàn)輕微病變，其他3 組肝實質(zhì)出現(xiàn)壞死，肝細(xì)胞溶解，肝靜脈擴張并嚴(yán)重充血。A 組小鼠腦組織無明顯病理變化，其余3 組有不同程度的病變，可見腦實質(zhì)部分出現(xiàn)壞死灶，有微血栓形成。

2.3 感染小鼠血清中重要炎性因子含量變化試驗結(jié)果如圖2 所示。小鼠血清中IL-12 僅在LM感染早期有較高的表達(dá)量，除D 組在4 h 達(dá)到峰值外，其他3 組均在8 h 達(dá)到峰值，感染后期4 組小鼠血清中IL-12 的含量與正常組無顯著差異（P＞0.05），單因素方差分析組間差異不顯著（P＞0.05）。小鼠血清中TNF-α在LM 感染早期有較高的表達(dá)量，4 組均在8 h 達(dá)到峰值，感染后期4 組小鼠血清中TNF-α的含量也略高于正常組，單因素方差分析組間差異不顯著（P＞0.05）。小鼠血清中INF-γ在LM 感染早期有較高的表達(dá)量，4 組均在8 h 達(dá)到峰值，在感染后期，除A 組僅略高于正常組外，其他3 組均有較高的表達(dá)量（P＜0.05），單因素方差分析組間差異不顯著（P＞0.05）。

3 討論

本試驗通過腹腔注射小鼠的方法研究不同毒力及濃度單增李斯特菌的致病性差異。LM 無論是通過何種方式感染動物機體，都需要經(jīng)過血液循環(huán)侵入機體各組織臟器，因此檢測小鼠心臟中細(xì)菌動態(tài)分布情況對證明小鼠感染模型建立是否成功及探討細(xì)菌遷移能力具有很重要的意義。腦炎是LM 的特征性病理癥狀，因此研究腦組織中細(xì)菌動態(tài)分布情況，對判斷致病力亦是十分重要的。本試驗4 組小鼠在心臟和腦中的動態(tài)分布情況不同，其中過量攻強毒株LMo 0586 的小鼠明顯比其他3 組的小鼠更早發(fā)現(xiàn)細(xì)菌，說明毒力強的LM 在小鼠體內(nèi)有更強的遷移能力，推測可能是過量的細(xì)菌使機體免疫系統(tǒng)不能及時清除細(xì)菌，從而導(dǎo)致細(xì)菌大量增殖所致；同時發(fā)現(xiàn)即使相同毒力（同為半數(shù)致死量）的強弱毒株在心臟和腦中的動態(tài)分布情況也存在差異，其中，1只感染強毒株的小鼠在感染后2 h 就可以在心臟中檢出細(xì)菌，感染后4 h，強毒株組的3 只受檢小鼠都可以在心臟中檢出細(xì)菌；而感染后2 h，弱毒株組未在心臟中檢出細(xì)菌，感染后4 h 弱毒株組的3 只受檢小鼠中還有1 只小鼠未在心臟中檢出細(xì)菌，說明兩株菌遷移能力和運動性存在差異，推測這兩株菌與運動性有關(guān)的基因（actA、plcB）發(fā)生的點突變可能對細(xì)菌毒力變化產(chǎn)生影響[7]。

圖1 小鼠肝臟和腦的病理變化，H.E.染色 （×10）

圖2 4組感染LM小鼠不同時期血清炎性因子含量變化 （pg/μL）

感染李斯特菌后4 組小鼠均出現(xiàn)了不同程度的病理變化。感染的細(xì)菌毒力越強，小鼠出現(xiàn)癥狀的時間越早，這與感染鼠心臟及腦中細(xì)菌動態(tài)分布情況相一致，除感染低劑量弱毒的小鼠未出現(xiàn)明顯的神經(jīng)癥狀外且試驗期間未出現(xiàn)死亡，其他3 組小鼠都出現(xiàn)了不同程度的神經(jīng)癥狀，感染同等毒力細(xì)菌的兩組小鼠有相似的癥狀及病理變化，感染不同劑量的同菌株的幾組小鼠間病變程度存在差異，感染同等劑量的幾組小鼠間病變程度差異顯著。試驗中4 組小鼠均出現(xiàn)了不同程度的脾臟和肝臟腫大，通過觀察肝臟組織切片，可明顯看出有肝細(xì)胞破裂、肝靜脈充血、腦實質(zhì)充血、壞死等病理變化。肝臟損傷程度與細(xì)菌毒力呈正相關(guān)，過量攻強毒的小鼠肝臟損傷嚴(yán)重；低劑量弱毒株小鼠腦組織無嚴(yán)重病理變化，與這組小鼠未出現(xiàn)顯著的神經(jīng)癥狀相一致，而此組小鼠腦中也檢出細(xì)菌，推測是由于增菌后進(jìn)行PCR 檢測這一方法敏感度過高，實際穿透血腦屏障的細(xì)菌數(shù)量極低，不足以引起明顯的腦損傷?？梢?，單增李斯特菌對小鼠的致病力存在顯著的劑量及毒力依賴性。

作為一種胞內(nèi)菌，機體對LM 的免疫反應(yīng)主要以細(xì)胞免疫為主，在感染后機體的整個免疫應(yīng)答過程中，TNF-α、IL-12 和IFN-γ都在清除LM感染中扮演著重要的角色。本試驗通過檢測小鼠血清中重要細(xì)胞因子的動態(tài)變化來研究機體對不同毒力LM的免疫應(yīng)答差異?？傮w來看，這3 種細(xì)胞因子的表達(dá)量都呈現(xiàn)出相似的變化趨勢，即在感染早期表達(dá)量上升至峰值，隨后逐漸下降至平穩(wěn)；經(jīng)組間比較可以看出，除高劑量攻強毒的小鼠比其他3 組小鼠更早的引起機體免疫應(yīng)答反應(yīng)外，4 組間無顯著差異?？梢钥闯?，不同毒力的單增李斯特菌可引起機體產(chǎn)生相似的免疫應(yīng)答。

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