傅秋玲，陳 珍，黃 瑜，傅光華，陳翠騰，萬春和，程龍飛，陳紅梅，施少華，林建生

（福建省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，福建 福州350013）

鴨1型甲肝病毒（duck hepatitis A virus 1，DHAV-1）是小RNA 病毒科（Pacornaviridae）禽肝病毒屬（Avihepatovirus）的成員之一，主要侵害6 周齡內(nèi)的雛鴨，以發(fā)病急、病程短、致死率高、病死鴨呈角弓反張、肝臟腫大、出血為臨床特征。

2005 年Guérin 等自表現(xiàn)胰腺炎和腦炎的番鴨中分離到鴨1 型甲肝病毒，而發(fā)病鴨肝臟未出現(xiàn)腫大、出血病變[1]。此后，未見類似病例報道。直至2011 年9 月，福建、浙江、上海、廣東等省份相繼出現(xiàn)10～30 日齡雛番鴨、半番鴨以胰腺泛黃、出血（俗稱胰腺炎）為特征的疫病，其發(fā)病率和病死率分別達10%～30%、25%～40%。本研究室對患該病的雛番鴨病例開展了病原學研究，并對已分離到的病毒進行蝕斑純化、形態(tài)特征、全基因組測序與分析、生物學及理化學特性和動物致病性試驗等一系列相關研究，結果發(fā)現(xiàn)，該病毒呈直徑20～40 nm 的球形粒子；其全基因組序列與DHAV-1 參考毒株核苷酸序列和氨基酸同源性分別介于93.5%～99.6%和97.9%～99.6%之間，結構蛋白vp1 基因與經(jīng)典的DHAV-1 的vp1 基因序列同源性較高；對家禽紅細胞和綿羊紅細胞無血凝活性[2-4]；雛番鴨和雛半番鴨對該病毒較易感、櫻桃谷雛鴨和雛麻鴨對該病毒不易感，而肝炎型的鴨1 型甲肝病毒卻對櫻桃谷雛鴨最易感，雛番鴨、雛半番鴨對其相對較不易感。綜合以上研究結果，確定其病原為鴨1 型甲肝病毒。但由于其特征性剖檢病變?yōu)橐认俜狐S、出血，完全不同于引起典型肝炎的DHAV-1（稱為經(jīng)典的肝炎型DHAV-1）所致的肝臟腫大、出血特征病變，為區(qū)別起見，將其暫定為胰腺炎型DHAV-1[2-4]。

為了明確引起雛鴨胰腺炎的新型DHAV-1 的分類地位，本研究采用固定病毒稀釋血清的方法對胰腺炎型DHAV-1 和經(jīng)典的肝炎型DHAV-1 進行血清交叉中和試驗，以此分析胰腺炎型DHAV-1 與經(jīng)典的肝炎型DHAV-1 間的抗原相關性，為對該病毒深入研究提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 毒株和試驗鴨胚 MPZJ1206 株胰腺炎型DHAV-1 和FJ1007 株經(jīng)典的肝炎型DHAV-1 由福建省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所禽病室分離、鑒定和保存。10 日齡鴨胚（無DHAV-1 母源抗體），購自華南生物農(nóng)大生物藥品有限公司。

1.2 方法

1.2.1 陽性血清抗體、陰性血清抗體的制備 陽性血清抗體是胰腺炎型DHAV-1（MPZJ1206 株）和經(jīng)典的肝炎型DHAV-1（FJ1007 株）病毒液分別經(jīng)甲醛（終濃度0.1%）滅活后與弗氏不完全佐劑按1∶1 比例進行乳化，首次免疫成年番鴨，間隔2周后，與弗氏完全佐劑乳化后再次免疫，3 免后采集血液制備血清，應用鴨胚中和試驗法測定抗血清效價，56 ℃滅活后分裝凍存?zhèn)溆谩ｊ幮匝蹇贵w的制備是采集自無DHAV-1 母源抗體鴨胚孵化而得的雛鴨，56 ℃滅活后分裝凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 胰腺炎型與經(jīng)典的肝炎型DHAV-1 鴨胚半數(shù)致死量（ELD50）的測定[7]分別對胰腺炎型DHAV-1（MPZJ1206株）和經(jīng)典的肝炎型DHAV-1（FJ1007株）病毒液用滅菌PBS 進行10 倍系列稀釋，將10-1-10-6每稀釋度按0.1 mL/胚的劑量接種5 枚10 日齡番鴨胚，37 ℃孵育，棄24 h 內(nèi)死亡胚，繼續(xù)孵育1 周并觀察記錄鴨胚死亡結果，按Reed-Meunch法計算ELD50。

1.2.3 血清交叉中和試驗 采用固定病毒稀釋血清法[5]。首先將抗胰腺炎型DHAV-1 MPZJ1206 或經(jīng)典的肝炎型DHAV-1 FJ1007 陽性血清用滅菌PBS 作倍比稀釋。且將含200ELD50/0.2 mL 的病毒（MPZJ1206 株胰腺炎型DHAV-1 或FJ1007 株經(jīng)典的肝炎型DHAV-1）分別與不同稀釋度的陽性血清等量混合，于37 ℃孵育l h。同時，另設病毒、血清和PBS 對照，然后分別將各中和組混合液與對照組混合液按0.2 mL/胚的劑量接種于5 枚10日齡鴨胚尿囊腔內(nèi)，棄24 h 內(nèi)死亡胚，記錄1 周內(nèi)的鴨胚死亡情況，以病毒對照全部死亡及血清、PBS 對照全部存活為試驗成立。試驗組以1 周內(nèi)有效死亡胚計算半數(shù)保護劑量（PD50）。以50%鴨胚保護的最高血清稀釋度為血清的中和效價。

1.2.4 判定標準 參照《動物病毒學》中口蹄疫病毒血清型和亞型的區(qū)分標準進行判定[5]，由異源血清與同源血清效價之比得到2 個比值（r1 和r2），即MPZJ1206 株胰腺炎型DHAV-1 分別與抗經(jīng)典的肝炎型DHAV-1（FJ1007 株）陽性血清和抗腺炎型DHAV-1（MPZJ1206 株）陽性血清之間反應測定的效價之比（r1）；FJ1007 株肝炎型DHAV-1 與抗腺炎型DHAV-1（MPZJ1206 株）陽性血清和抗經(jīng)典的肝炎型DHAV-1（FJ1007 株）血清之間反應測定的效價之比（r2）。再根據(jù)公式親緣值（R 值）：R=√r1×r2 計算得出。

2 結果

2.1 胰腺炎型與經(jīng)典的肝炎型DHAV-1 的ELD50測定結果 MPZJ1206 株胰腺炎型DHAV-1 和FJ1007 株經(jīng)典的肝炎型DHAV-1 接種10 日齡鴨胚后，每天照胚3 次，統(tǒng)計1 周內(nèi)鴨胚的死亡數(shù)量。按Reed-Meunch 法分別計算MPZJ1206 株胰腺 型DHAV-1 的ELD50為10-5.58/mL 和FJ1007 株 經(jīng)典的肝炎型DHAV-1 的ELD50 為10-6.69/mL-1。

2.2 鴨胚交叉中和效價及R 值 采用固定病毒（200ELD50/0.2 mL）稀釋血清法對胰腺炎型DHAV-1 毒株（MPZJ1206 株）和經(jīng)典的肝炎型DHAV-1 毒株（FJ1007 株）進行鴨胚交叉中和試驗。利用交叉中和抗體效價按公式計算兩種間的親緣值（R 值）（表1）：R=√r1×r2=√（89.1/169.8）×（91.2/125.9）=0.62。因此，R 值范圍為0.32＜R＜0.7，表明胰腺炎型DHAV-1 屬于鴨1 型甲肝病毒亞型（DHAV-1a）。

表1 兩種D H A V-1與相應抗血清交叉中和試驗效價及R 值結果

3 結論與討論

鴨甲肝病毒（DHAV）包含3種基因型，分別為傳統(tǒng)的血清1 型鴨甲肝病毒、臺灣新型鴨甲肝病毒和韓國型鴨甲肝病毒（即DHAV-1、DHAV-2 和DHAV-3），在我國主要流行DHAV-1 和DHAV-3[8-11]。雛鴨感染鴨甲肝病毒后多呈現(xiàn)角弓反張臨床癥狀，肝臟呈特征性腫大、出血性病理變化，這些特征性的臨床癥狀及剖檢病變?yōu)榕R床快速診斷該病提供重要依據(jù)。直至2011 年下半年，我國浙江省金華、麗水等地及福建省的莆田、福州等地7～30 日齡的雛番鴨發(fā)生以胰腺泛黃、出血（暫稱為胰腺炎）為特征的疫病。至今，浙江、福建、上海、廣東、江西和廣西6?。ㄊ小⒆灾螀^(qū)）的雛番鴨和雛半番鴨均有發(fā)生此病，對我國的養(yǎng)鴨業(yè)構成極大危害。經(jīng)過一系列研究發(fā)現(xiàn)，該病病原屬于鴨1 型甲肝病毒。但胰腺炎型DHAV-1不能完全被經(jīng)典的DHAV-1血清所中和[6]。這表明胰腺炎型DHAV-1 可能為DHAV-1 的亞型。

根據(jù)病毒抗原性的不同作為病毒分類的主要依據(jù)，特別是應用在劃分同種病毒的不同型及亞型過程中。因為病毒與抗血清之間的中和反應極其敏感，且具有嚴格的種、型特異性。因此，通常采用血清交叉中和試驗的方法判定不同毒株間的抗原關系[12]。毒株間親緣關系與交叉反應的程度呈正相關[5]。例如與鴨肝炎病毒同屬小RNA病毒的口蹄疫病毒利用血清交叉中和試驗計算不同毒株間的R 值，以區(qū)分鑒定血清型及亞型。本研究利用鴨胚交叉中和試驗測定了胰腺炎型DHAV-1 與經(jīng)典的肝炎型DHAV-1 的交叉中和效價，計算得出胰腺炎型DHAV-1 與經(jīng)典的肝炎型DHAV-1 的R 值，R 值的范圍處于（0.32，0.7）之間，這表明胰腺炎型DHAV-1 屬于鴨甲肝病毒的亞型（DHAV-1a）。因此本研究通過分析該病毒的抗原性明確了胰腺炎型DHAV-1 的分類地位，這為今后對該病毒進行深入的研究奠定基礎。

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