李春艷，張秀英，張燕華，徐 尚

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150030）

脂肪酸是脂質(zhì)的重要組成元件，在各種組織中都表現(xiàn)出重要的生物學(xué)功能。研究表明，脂肪酸與胰島素抵抗、冠狀動(dòng)脈疾病、高血壓、肥胖等慢性病密切相關(guān)[1]。在健康狀態(tài)下，機(jī)體組織中的脂肪酸處于相對(duì)平衡狀態(tài)，一旦機(jī)體患病，這種平衡將會(huì)打破，組織中的脂肪酸組成也將發(fā)生改變。因此，建立血清及肝組織中脂肪酸的定性、定量及快速檢測(cè)方法對(duì)醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究及臨床檢驗(yàn)均具有極其重要的意義，對(duì)血清與肝組織中脂肪酸譜的綜合分析也將有助于深入揭示不同脂肪酸間以及血清和肝組織脂肪酸變化間的相關(guān)性[2]。氣相色譜法是脂肪酸分析中最常用的方法，也是ISO 和AOCS 中所采用的方法。本試驗(yàn)采用該方法測(cè)定小鼠血清和肝臟17 種脂肪酸的含量，為進(jìn)一步闡明脂肪酸與疾病預(yù)防和治療的關(guān)系、尋找潛在的異常代謝途徑或致病機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑 日本島津GC-14C 氣相色譜分析儀，氫火焰離子化檢測(cè)器（FID），色譜工作站（N3000），脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品和13%BF3-甲醇溶液，均購(gòu)自Sigma 公司，氯仿和甲醇為色譜純。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 稱取每種脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，分別置于5 mL 棕色容量瓶中，用正己烷溶解并定容，充分搖勻，配制成1 mg/mL 脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品的貯備液，吹入氮?dú)?，密封? ℃保存。

1.3 色譜條件 毛細(xì)管色譜柱為DB-23（30 m×0.25 mm×0.25 μm，Agilent 公司）；載氣為氮?dú)猓?9.999%）：流速50 mL/min，氫氣：流速50 mL/min，空氣：流速500 mL/min；進(jìn)樣1 μL；分流比為1∶30；進(jìn)樣器溫度240 ℃；檢測(cè)器溫度260 ℃；柱溫程序升溫：初始柱溫50 ℃，保持2 min，升溫速率20 ℃/min，升到170 ℃保持1 min，2 ℃/min 升至240 ℃保持10 min。

1.4 樣品處理 樣品采集：健康雄性ICR 小鼠，眼球摘除采血，分離血清，并剖檢取出肝臟，保存于-80 ℃冰箱。樣品萃?。悍Q取肝臟組織100 mg，減碎置勻漿器中，加入1 mL 生理鹽水，冰浴中研磨成勻漿，加入三氯甲烷2 mL 甲醇1 mL[3]，充分混勻，共重復(fù)兩次，合并兩次提取液[4]，3 000 r/mim離心10 min，除去上層液相，下層有機(jī)相在氮?dú)饬鞔蹈桑?20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｑ簶颖揪_稱取100 μL，直接進(jìn)行皂化衍生。皂化衍生：取出凍存提取物，加0.5 mol/LKOH-甲醇溶液1 mL，充氮?dú)饷芊猓?0 ℃水浴10 min，加13% BF3-甲醇1.5 mL，60 ℃水浴40 min，取出置冷，加入正己烷1.5 mL，渦流1 min 提取。加入飽和氯化鈉溶液2 mL，3 000 r/mim 離心15 min，靜置5 min，取上層液于螺口試管中，吹入氮?dú)?，密封? ℃冰箱保存。1 μL 進(jìn)樣進(jìn)行氣相色譜分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用正己烷分別稀釋為8 個(gè)系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，按照1.5 皂化衍生方法處理后進(jìn)行分析，將相對(duì)應(yīng)的脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品濃度y 和脂肪酸的色譜峰面積x 做線性回歸，其相應(yīng)的回歸方程和相關(guān)系數(shù)如表1。

表1 脂肪酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍

2.2 小鼠血清與肝組織中脂肪酸的檢測(cè) 圖譜如 圖1 所 示，出 峰 順 序 依 次 為C12、C14、C15、

C16、C17、C18、C18∶1、C18∶2、C18∶3、C20、C20∶1、C20∶2、C20∶3、C20∶4、C22、C23、C22∶6，根據(jù)6次進(jìn)樣確定脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間進(jìn)行定性（如表1 所示）。其中血清和肝臟樣本中飽和脂肪酸C20 及C23 僅在極少量樣本中有顯示，無法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2.3 回收率及精密度 準(zhǔn)確稱取小鼠肝臟100 μg 和血清100 μL，分別各自加入低、中、高3 個(gè)濃度的脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按1.4 方法操作，每一濃度重復(fù)處理并進(jìn)樣5 次，根據(jù)峰面積計(jì)算加標(biāo)回收率和日內(nèi)變異系數(shù)，連續(xù)測(cè)5 d，計(jì)算日間變異系數(shù)。結(jié)果如表2 和表3 所示。

2.4 靈敏度的測(cè)定 取空白血清和肝臟，按照1.4 中的樣品處理方法處理后，測(cè)得基線噪音值，分別按3 倍信噪比和10 倍信噪比獲得該方法的檢測(cè)限和定量限。結(jié)果如表1 所示。

圖1 氣相色譜

表2 血清中脂肪酸不同質(zhì)量濃度的回收率和變異系數(shù)

表3 肝臟中脂肪酸不同質(zhì)量濃度的回收率和變異系數(shù)

3 討論

3.1 色譜條件的選擇 本試驗(yàn)所研究的脂肪酸種類多、范圍廣、沸點(diǎn)范圍較大，因此我們采用程序升溫和專門為分離脂肪酸甲酯而設(shè)計(jì)的強(qiáng)極性柱。程序升溫過程我們借鑒了Ma 等[5]的報(bào)道，并進(jìn)行了優(yōu)化。從色譜圖看，組織中的脂肪酸均得到了很好的分離。

3.2 樣品處理方法的優(yōu)化 在預(yù)試驗(yàn)中，我們對(duì)短期的冰凍組織和新鮮組織分別進(jìn)行了脂肪酸含量的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)二者差別不顯著，所以短期的冰凍對(duì)脂肪酸含量的測(cè)定沒有影響。

在肝臟組織前處理中，我們采用了經(jīng)典的Floch 法，經(jīng)過兩次抽提以減少脂質(zhì)丟失。對(duì)甲酯化的溫度和時(shí)間進(jìn)行研究，結(jié)果篩選出的脂肪酸甲酯化最佳條件是60 ℃和40 min，與Intorre 等[6]的衍生化條件較接近。在衍生化后，我們選擇提取層溶液直接進(jìn)樣分析，而不是大多文獻(xiàn)[2]采用的氮?dú)獯蹈珊髲?fù)溶再進(jìn)樣分析。前期我們通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)經(jīng)過氮?dú)獯蹈珊笤購(gòu)?fù)溶會(huì)使一些脂肪酸的含量變低，可能是由于一些脂肪酸甲酯具有較高的揮發(fā)性。

3.3 方法學(xué)的驗(yàn)證 在試驗(yàn)條件下，組織中17 種脂肪酸的檢測(cè)限范圍是100 ng/mL～300 ng/mL。比國(guó)標(biāo)[7]中報(bào)道的檢測(cè)限低。在高、中、低3 個(gè)添加濃度水平下，測(cè)得小鼠血清和肝臟回收率均大于80.72%，精密度小于5.74%。說明本方法測(cè)定組織中脂肪酸具有準(zhǔn)確度好、重現(xiàn)性穩(wěn)定、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，為脂肪酸含量檢測(cè)提供了簡(jiǎn)便、快速、靈敏、準(zhǔn)確的方法。

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