許楚楚，劉健男，夏 成，張洪友，徐 闖

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江 大慶163319）

微量元素Cu 是維持奶牛機(jī)體正常新陳代謝的重要物質(zhì)，在20 世紀(jì)初，Cu 就被認(rèn)為是動(dòng)物營養(yǎng)中必須的微量元素。Underwood 等報(bào)道，奶牛血漿Cu的正常含量為0.576～0.96 mg/L（9～15 mmol/L），當(dāng)血漿中Cu 含量低于該值時(shí)視為缺乏[1]。

動(dòng)物機(jī)體的抗氧化能力能反映機(jī)體對不良環(huán)境和疾病的抵抗能力?？寡趸w系中酶促反應(yīng)體系主要包括一些酶，它們有超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等，這些酶的活性中心是微量元素?？偪寡趸芰Γ═-AOC）能反映動(dòng)物體內(nèi)兩套抗氧化體系總能力高低的指標(biāo)，常常用于臨床生化檢驗(yàn)[2]。銅藍(lán)蛋白（CP）是一種與免疫系統(tǒng)密切相關(guān)的銅蛋白，其作用為調(diào)節(jié)銅在機(jī)體各個(gè)部位的分布、合成含銅的酶蛋白，有著抗氧化劑的作用，并具有氧化酶活性，對多酚及多胺類底物有催化其氧化的能力[3]。當(dāng)前，由于我國奶牛泌乳量的不斷提高，銅缺乏的亞臨床病例不斷增加，增高了機(jī)體對疾病的易感性，機(jī)體患病的風(fēng)險(xiǎn)明顯增大。因此，本試驗(yàn)通過檢測泌乳奶牛微量元素Cu 和氧化應(yīng)激指標(biāo)的變化，不僅能闡明泌乳奶牛銅缺乏與機(jī)體氧化應(yīng)激的關(guān)系，而且能探索銅缺乏的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警體系，為今后更有效的預(yù)防Cu 缺乏和提高機(jī)體抗氧化應(yīng)激能力提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 在黑龍江省某集約化規(guī)范化千頭牛場，泌乳奶牛采用散欄式飼養(yǎng)，TMR 全混日糧飼喂方式。選取體況相近（2.5～3.5），胎次相近（2～3 胎）的荷斯坦奶牛156 頭。試驗(yàn)動(dòng)物根據(jù)血漿Cu 水平，血漿Cu 含量小于9 mmol/L 為Cu 缺乏組，大于9 mmol/L 為Cu 正常牛。根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)將奶牛分為Cu 缺乏組26 頭，Cu 正常組130 頭。

1.2 樣品采集和分析 所有的試驗(yàn)?zāi)膛Ｇ宄靠崭刮察o脈采集血樣10 mL，加肝素（20 μ/mL）抗凝，（3 500 r/min 離心10 min），分離血漿-80 ℃凍存。利用分光光度法測定血漿Cu 水平，Cu 試劑盒，購自南京建成生物工程公司；采用UNICO7200分光光度計(jì)（尤尼柯上海儀器有限公司提供）測定超氧化物歧化酶（SOD）、總抗氧化能力（T-AOC）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和銅藍(lán)蛋白（CP）等，它們的試劑盒，均購自南京建成生物工程公司。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 試驗(yàn)牛血漿Cu 和氧化應(yīng)激指標(biāo)的比較 由表1 可知，Cu 缺乏組的CP 水平顯著低于Cu 正常組（P=0.000），Cu 缺乏組的T-AOC 水平顯著高于Cu 正常組（P=0.004）。Cu 缺乏組的SOD、GSH-Px水平和正常組無顯著差異（P=0.076，P=0.585）。

表1 試驗(yàn)牛血漿C u和氧化應(yīng)激指標(biāo)的水平（平均數(shù)±SD）

2.2 試驗(yàn)?zāi)膛Ｑ趸笜?biāo)與Cu 的相關(guān)性分析 由表2 可知，血漿中CP（R=0.049，P=0.00）與Cu 缺乏呈極顯著正相關(guān)，T-AOC（R=0.218，P=0.006）與Cu缺乏呈極顯著負(fù)相關(guān)，SOD（R=0.074，P=0.356）與Cu 缺乏無相關(guān)性，GSH-Px（R=-0.025，P=0.756）與Cu 缺乏無相關(guān)性。

2.3 試驗(yàn)?zāi)膛Ｑ趸瘧?yīng)激指標(biāo)對銅缺乏的預(yù)警作用 在表3 中列出了泌乳奶牛Cu 缺乏預(yù)警相關(guān)指標(biāo)的分界值、敏感度和特異度及其各自的標(biāo)準(zhǔn)誤、陽性似然比和曲線下面積。通過計(jì)算Youden指數(shù)確定的最佳分界值和對應(yīng)的敏感度和特異度。 由表3 和圖1 可知，各項(xiàng)氧化指標(biāo)中CP 對Cu缺乏的診斷意義較大（AUC=0.709，P=0.001），臨界值為13.7U/L。

表2 奶?？寡趸笜?biāo)與C u缺乏的相關(guān)性

表3 氧化應(yīng)激指標(biāo)對C u缺乏診斷R O C 分析

3 討論

奶牛機(jī)體正常情況下，機(jī)體的抗氧化能力和源源不斷產(chǎn)生的氧自由基的氧化能力之間保持著一個(gè)動(dòng)態(tài)的平衡關(guān)系，以確保機(jī)體組織免于氧化損傷。當(dāng)抗氧化能力下降或者自由基產(chǎn)生異常增多的時(shí)候，將會導(dǎo)致組織的氧化損傷，從而促發(fā)許多疾病[4]。為防護(hù)氧自由基對生物膜的損傷，動(dòng)物機(jī)體有著一套完善的抗氧化防御系統(tǒng)。按其性質(zhì)可分為酶抗氧化系統(tǒng)和非酶抗氧化系統(tǒng)，酶抗氧化系統(tǒng)是有T-AOC、SOD、GSH-Px 等。非酶抗氧化系統(tǒng)中Cu、Mn、Zn、Se 是酶抗氧化指標(biāo)的活性中心，直接影響這些酶的活性[5]。研究表明，Cu 在抗氧化作用方面，通過不同的方式發(fā)揮著重要的作用。當(dāng)動(dòng)物缺Cu 時(shí)，體內(nèi)發(fā)生的各種病理或者生理變化與過氧化物的作用關(guān)系非常密切[6]。

本試驗(yàn)中，T-AOC 與Cu 缺乏呈極顯著負(fù)相關(guān)（R=-0.218，P=0.006）。正常情況下，體內(nèi)產(chǎn)生超氧陰離子自由基、過氧化氫等強(qiáng)氧化劑被抗氧化酶系及時(shí)清除。當(dāng)Cu 缺乏時(shí)，抗氧化酶系活性降低，超氧陰離子自由基和過氧化氫積累，過量的超氧陰離子自由基使NO 氧化生成過氧硝酸鹽直接攻擊生物膜，發(fā)生脂質(zhì)過氧化，使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化，流動(dòng)性降低，導(dǎo)致細(xì)胞機(jī)能降低[7]。過量的過氧化氫使Cu2+形成Cu+O、Cu2+-OH攻擊酶臨近組氨酸殘基，使許多酶失活。過量的超氧陰離子自由基和過氧化氫還可使還原性谷胱甘肽氧化生成氧化型谷胱甘肽，從而反饋性抑制GSH-Px 的活性。當(dāng)動(dòng)物缺Cu 時(shí)，主要是通過大量活性氧改變免疫活性細(xì)胞的表面結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致組織內(nèi)SOD 和GSH-Px 活性降低[8]。但本試驗(yàn)中血漿中SOD 和GSH-Px 的含量和Cu 缺乏的關(guān)系不顯著。柴春彥[9]等研究表明，Cu 缺乏臨床組SOD 和GSH-Px 的含量和對照組差異明顯，但是亞臨床組SOD 和GSH-Px 的含量和對照組差異不顯著。本試驗(yàn)的中SOD 和GSH-Px 的含量和Cu 缺乏關(guān)系不顯著原因可能與Cu 缺乏的程度有關(guān)。

CP作為一種抗氧化劑并且是組織中Cu的供體，不僅參與血漿Cu 的運(yùn)輸，也可清除機(jī)體內(nèi)的O2-自由基，CP 具有類似超氧化物歧化酶的作用[10]。本試驗(yàn)中，血漿中CP（R=0.490，P=0.00）與血漿Cu 呈極顯著正相關(guān)。Kincaid 等[11]研究表明，血漿CP與血漿Cu的相關(guān)系數(shù)為0.50；何寶祥等[12]報(bào)道，育成奶牛血漿CP 與血漿Cu 的相關(guān)系數(shù)為0.92，相關(guān)系數(shù)均高于本試驗(yàn)結(jié)果和Kincaid 等報(bào)道的結(jié)果。蔡永華等[13]報(bào)道，血漿CP 與血漿Cu 兩者的相關(guān)系數(shù)可達(dá)0.50或0.64 并且成正相關(guān)，當(dāng)補(bǔ)Cu 后血漿Cu 恢復(fù)正常，相關(guān)性明顯降低，說明CP 活性與血漿Cu 密切相關(guān)，特別是血漿Cu 水平低時(shí)，相關(guān)性較高。王宗元和何寶祥都認(rèn)為CP 測定有利于大范圍的調(diào)查，且可代替血漿Cu 的檢測[14]。本試驗(yàn)在相關(guān)性分析中顯示CP可作為Cu 缺乏發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)因素（OR=1，P=0.012）。ROC 結(jié)果顯示CP 可作為Cu 缺乏預(yù)警指標(biāo)（AUC=0.709，P=0.001），臨界值為13.7U/L。

綜上所述，本試驗(yàn)中泌乳奶牛血漿中CP、TAOC 與銅缺乏密切相關(guān)，然而僅CP 可作為泌乳奶牛Cu 缺乏的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警指標(biāo)。

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