呂曉萍，高雪麗，劉超男，申海龍，鄭世民

（1.東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，黑龍江 哈爾濱150030 ；2.浙江省長興縣農(nóng)業(yè)局，浙江 長興313100）

益生菌是指通過攝入適量從而對宿主產(chǎn)生有益作用的活菌。其是機體腸道共生菌群的重要組成部分，形成并維持腸道菌群的動態(tài)平衡[1-2]，可提高機體細胞免疫和體液免疫，增強機體抵抗力[3]。隨著養(yǎng)殖業(yè)的大規(guī)模發(fā)展，因飼養(yǎng)者濫用抗生素，導致動物產(chǎn)生耐藥性而無法控制某些疾病的發(fā)展和蔓延。為改變這一現(xiàn)狀，人們著力尋找能替代抗生素的天然添加劑。目前研究和使

用最多的是各種益生菌，其天然，無毒副作用，無殘留，不污染環(huán)境，還可提高動物抗應激能力和機體的免疫功能[4]。本文旨在通過對雛雞消化道局部黏膜免疫組織CD4+、CD8+T 細胞亞型數(shù)量動態(tài)變化的研究，從亞細胞水平上檢測局部黏膜組織細胞免疫功能變化，揭示雛雞飼喂益生菌、益生菌與ND 疫苗聯(lián)合應用后，雛雞局部黏膜組織細胞免疫變化規(guī)律，為益生菌在動物界的研發(fā)和應用提供科學試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 1 日齡艾維因混合肉雛雞100 只，購自哈爾濱某孵化場。經(jīng)雞傳染性囊病、雞馬立克病和雞傳染性支氣管炎等抗體檢測均為陰性。

1.2 試驗主要試劑 產(chǎn)酶益生菌，購自山東華爾康生物技術有限公司；新城疫疫苗，購自哈藥集團生物疫苗有限公司；鼠抗雞CD4（CD8）單克隆抗體（代號8210-01 和8220-01），購自Southern Biotech 公司。

1.3 試驗動物分組及處理 100 只雛雞隨機分為益生菌組（簡稱P 組）、ND 疫苗組（簡稱V 組）、益生菌聯(lián)合ND 疫苗免疫組（簡稱P+V 組）和對照組（簡稱C 組）4 組，每組25 只雛雞，分別做如下處理：

P 組：雛雞分別于1 日齡和18 日齡連續(xù)灌服益生菌稀釋液3 d，1 次/天；V 組：雛雞分別于1 日齡和18 日齡連續(xù)灌服生理鹽水3 d，1 次/天，并分別于在10 日齡和21 日齡經(jīng)點眼、滴鼻接種新城疫弱毒苗，其中21日齡疫苗免疫劑量為10日齡的2倍；P+V組：雛雞除將V 組的灌服生理鹽水改為灌服益生菌外，其他處理與V組相同；C組：雛雞分別于1 日齡和18日齡連續(xù)灌服生理鹽水3 d，1 次/d，為對照。

1.4 試驗材料采取及處理 C、P、V、P+V 組雛雞分別于首次疫苗免疫后第0、7、14、28 天和第42天，每組隨機抽取5 只雛雞，心臟采血處死，快速采取盲腸扁桃體、十二指腸和回腸派伊爾結固定于4 ℃預冷的10%中性福爾馬林緩沖液中，于冰箱4 ℃固定24 h。

1.5 CD4+、CD8+T 細胞數(shù)量檢測及方法-組織石蠟切片及免疫酶組織化學染色法（SP法）（1）前期處理：包括取材、充分固定24 h，梯度酒精脫水，二甲苯透明，58 ℃浸蠟2 h，石蠟包埋后，常規(guī)切片（4 μm）、烤片，切片脫蠟，梯度酒精水化；（2）3%H2O2室溫阻斷15 min，PBS 洗；（3）0.1%胰蛋白酶消化10 min，PBS洗；（4）微波修復抗原：中火5 min，停5 min，解凍檔2 min，涼至室溫后取出切片；（5）山羊血清封閉室溫20 min，PBS 洗；（6）加入一抗：分別滴加1∶200 稀釋的MAC-CD4或MAC-CD8單克隆抗體，于濕盒內(nèi)4 ℃過夜，PBS 洗；（7）加入二抗：滴加生物素標記的山羊抗小鼠IgG，37 ℃孵育15 min，PBS 洗；（8）滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液37 ℃孵育15 min，PBS 洗；（9）DAB 避光顯色，室溫5 min，PBS 洗；（10）蘇木素復染，梯度酒精脫水，透明，中性樹膠封片。每次染色均設一抗和二抗陰性對照片。

結果檢驗：參考Romppanen 格點計數(shù)法[5]（point counting method），油鏡檢查免疫組織特定區(qū)域，以103x細胞/cm2表示。陽性判定：特定區(qū)域出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應。陽性分3 個等級，弱陽性呈淡棕黃色，顆粒細；強陽性呈深棕黃色，顆粒粗；中度陽性介于二者之間。注意區(qū)分非特異性染色，如組織邊緣、刀痕處或某局部的均勻著色。

1.6 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS13.0 軟件進行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)以平均值±標準誤（“-X ±S”）表示。

2 結果

2.1 益生菌聯(lián)合ND 疫苗免疫雛雞盲腸扁桃體CD4+、CD8+T 細胞數(shù)量變化

2.1.1 益生菌聯(lián)合ND 疫苗免疫雛雞盲腸扁桃體CD4+T 細胞數(shù)量變化 雛雞接種ND 疫苗后42 d內(nèi)，益生菌聯(lián)合ND 疫苗免疫雛雞、ND 疫苗單獨免疫雛雞，其盲腸扁桃體彌散區(qū)和淋巴小結的CD4+T 細胞數(shù)量均不同程度高于益生菌雛雞和對照雛雞，于疫苗免疫后7～28 d 差異明顯（P＜0.05或P＜0.01）；益生菌雛雞高于對照雛雞（表1）。

表1 益生菌聯(lián)合ND 疫苗免疫雛雞盲腸扁桃體C D 4+T 細胞數(shù)量變化

2.1.2 益生菌聯(lián)合ND疫苗免疫雛雞盲腸扁桃體CD8+T 細胞數(shù)量變化 雛雞接種ND 疫苗后7～42 d，益生菌聯(lián)合ND疫苗免疫雛雞、ND疫苗單獨免疫雛雞，其盲腸扁桃體彌散區(qū)和淋巴小結的CD8+T 細胞數(shù)量均不同程度地低于未接種疫苗的益生菌雛雞和對照雛雞，其分別于7～14 d 和7～28 d 差異顯著（P＜0.05 或P＜0.01）（表2）。

表2 益生菌聯(lián)合ND 疫苗免疫雛雞盲腸扁桃體C D 8+T 細胞數(shù)量變化

2.2 益生菌聯(lián)合ND 疫苗免疫雛雞腸派伊爾結CD4+、CD8+T 細胞數(shù)量變化

2.2.1 益生菌聯(lián)合ND 疫苗免疫雛雞腸派伊爾結CD4+T 細胞數(shù)量變化 雛雞接種ND 疫苗后42 d內(nèi)，益生菌聯(lián)合ND 疫苗免疫雛雞、ND 疫苗單獨免疫雛雞，其十二指腸和回腸派伊爾結CD4+T 細胞數(shù)量均不同程度高于益生菌雛雞和對照雛雞，于疫苗免疫后7～14 d 差異明顯（P＜0.05 或P＜0.01）；益生菌雛雞高于對照雛雞（表3）。

表3 益生菌聯(lián)合ND 疫苗免疫雛雞腸派伊爾結C D 4+T 細胞數(shù)量變化

2.2.2 益生菌聯(lián)合ND疫苗免疫雛雞腸派伊爾結CD8+T 細胞數(shù)量變化 雛雞接種ND 疫苗后7～42 d，益生菌聯(lián)合ND疫苗免疫雛雞、ND疫苗單獨免疫雛雞，其十二指腸和回腸派伊爾結CD8+T 細胞數(shù)量于7～28 d明顯低于益生菌雛雞和對照雛雞，（P＜0.05或P＜0.01）（表4）。

表4 益生菌聯(lián)合ND 疫苗免疫雛雞腸派伊爾結C D 8+T 細胞數(shù)量變化

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，雛雞接種ND疫苗后7～42 d，益生菌聯(lián)合ND 疫苗免疫雛雞、ND 疫苗單獨免疫雛雞，其盲腸扁桃體和十二指腸及回腸派伊爾結CD4+T 細胞數(shù)量均不同程度高于益生菌雛雞和對照雛雞；于免疫后7～14 d 差異明顯（P＜0.05 或P＜0.01）。表明益生菌聯(lián)合新城疫疫苗應用，提高了雛雞消化道局部黏膜組織的細胞免疫水平。產(chǎn)生上述變化的可能原因是：疫苗作為抗原進入機體后，首先被以巨噬細胞為主的抗原提呈細胞捕獲，一方面對其加工處理，濃集抗原決定簇于細胞表面；另一方面分泌細胞因子IL-1，在MHCII 類分子作用下，輔助性Th細胞（CD4+T 細胞亞群）識別并接受相應抗原決定簇和IL-1刺激，活化淋巴母細胞。致敏的Th 細胞表面表達IL-2 受體，同時釋放多種細胞因子，如IFN-γ、IL-6 等，參與細胞免疫。

本試驗還發(fā)現(xiàn)，ND 疫苗免疫雛雞后7～42 d，益生菌聯(lián)合ND 疫苗免疫雛雞的局部黏膜免疫組織CD4+T 細胞數(shù)量均不同程度高于ND 疫苗單獨免疫雛雞，表明益生菌與ND 疫苗聯(lián)合使用，增強了雛雞局部黏膜的細胞免疫功能。雛雞接種ND疫苗后7～42 d，益生菌聯(lián)合ND 疫苗免疫雛雞，其盲腸扁桃體和十二指腸及回腸派伊爾結CD8+T細胞數(shù)量明顯低于未接種疫苗的益生菌雛雞和對照雛雞。其中，盲腸扁桃體彌散區(qū)和回腸派伊爾結的CD8+T 細胞數(shù)量在7～14 d 差異明顯（P＜0.05 或P＜0.01）；盲腸扁桃體淋巴小結區(qū)和十二指腸派伊爾結在7～28 d 差異顯著或極顯著（P＜0.05或P＜0.01）；益生菌聯(lián)合ND 疫苗免疫雛雞和ND疫苗單獨免疫雛雞局部黏膜免疫組織的CD8+T 細胞數(shù)量在ND 疫苗免疫后28～42 d 與益生菌雛雞和對照雛雞基本趨于一致。產(chǎn)生上述變化的可能原因是：在ND 疫苗刺激機體初期和中期，CD4+T、CD8+T 細胞的變化特點，是有利于B 細胞激活、抗體產(chǎn)生和細胞因子的釋放。疫苗接種后，如果疫苗組分中的抗原通過B 細胞表面受體識別并攝取至胞內(nèi)，加工后由MHCII 類分子呈遞給CD4+T細胞，使其活化并分泌IL-2、IL-4 和IL-5 等細胞因子，這些細胞因子與B 細胞表面相應受體結合，促進B 細胞增殖、分化，產(chǎn)生針對相應抗原的抗體。如果B 細胞受到ND 弱毒感染，則內(nèi)源性抗原由MHC I 類分子呈遞給CD8+T 細胞，并誘導CTL前體細胞分化為效應CTL，殺傷感染的B 細胞。本試驗中CD8+T 細胞數(shù)量減少，表明試驗中大部分疫苗抗原被捕獲后，主要呈遞給輔助性CD4+T細胞，進而輔助B 細胞產(chǎn)生抗體。CD8+T 細胞數(shù)量減少抑制了自身殺傷作用的發(fā)揮，從另一角度講，也間接協(xié)助抗體產(chǎn)生。本試驗中疫苗接種是通過滴鼻、點眼途徑，更有利于直接刺激黏膜免疫系統(tǒng)，CD4+T、CD8+T 細胞數(shù)量的變化不但反映其功能，也反映了機體的免疫狀態(tài)。益生菌可以進行免疫調節(jié)，主要與機體特異性微生物或與腸上皮細胞的相互作用有關[6]。靳二輝等發(fā)現(xiàn)[7]，添加芽孢桿菌類益生素可明顯增加21 日齡和42 日齡肉雞的免疫器官指數(shù)，表明芽孢桿菌類益生素對肉雞免疫器官發(fā)育有明顯促進作用。溫建新等[8]研究發(fā)現(xiàn)，乳酸L-68 型糞腸球菌對艾維因肉雞的免疫器官發(fā)育有促進作用，能提高免疫器官指數(shù)，提高機體抗病能力。進一步表明益生菌和ND 疫苗的聯(lián)合應用，提高了機體對ND 疫苗的免疫應答和黏膜細胞免疫水平。

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