顧貴波，于學(xué)武，譚立文，陳 瑤，魏 澍，趙 培，王 竹，魏園園，曹明慧

（1.遼寧省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，遼寧 沈陽(yáng)110164 ；2.大連市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，遼寧 大連116037；3.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 海淀100081）

1974 年，德國(guó)科學(xué)家Tischer 在多株連續(xù)傳代PK-15 細(xì)胞系（ATCC-CCL31）中發(fā)現(xiàn)豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus，PCV）。PCV 有PCV-1 和PCV-2兩個(gè)血清型，其中，PCV-2 感染可引起多種綜合征疫病，主要包括PMWS、PDNS、SAMS、PRDC[1]、CT[2]、壞死性淋巴腺炎及滲出性皮炎[3]等多種疾病，這些疾病被統(tǒng)稱為豬圓環(huán)病毒?。≒CVD），或統(tǒng)稱為豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾?。≒CVAD）。

目前，PCVD 已在全球均有發(fā)生，給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)損失巨大，自1991 年加拿大薩斯喀徹溫省首次報(bào)道本病以來(lái)，世界各地也相繼出現(xiàn)

了有關(guān)本病的報(bào)道，包括美國(guó)、法國(guó)、英國(guó)、西班牙、丹麥、瑞士、意大利、荷蘭、日本、韓國(guó)等二十多個(gè)國(guó)家；雖然全球眾多國(guó)家和地區(qū)都存在圓環(huán)病毒病，以及由PCV2 引發(fā)的相關(guān)疾病，但各地的流行態(tài)勢(shì)和毒株分布存在有較大差異[1]。郎洪武等[4]證實(shí)我國(guó)豬群PCV2 感染達(dá)42.9%以上。王忠田等[5]對(duì)從我國(guó)所分離的6 株P(guān)CV2 毒株的病毒核酸同源性均在95%以上，與歐美毒株同源性為94.4%～99.7%。我們應(yīng)用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，對(duì)在遼寧省豬群PCV2 的流行情況及基因遺傳演化進(jìn)行調(diào)查分析，為遼寧地區(qū)豬群PCVD 診斷、綜合防制及研究提供重要的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 DNA Marker DL-2 000、E.coli JM109 感受態(tài)菌等為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。豬圓環(huán)病毒Ⅱ型熒光PCR 檢測(cè)試劑盒（TaqMan 探針?lè)ǎ楸本┥粕袃x科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 遼寧豬群PCV-2 流行情況調(diào)查 對(duì)遼寧14個(gè)地區(qū)的門診、屠宰場(chǎng)，針對(duì)PCV-2 進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，采集相應(yīng)的組織病料，低溫冷藏條件下，快速運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室，用于PCV-2 核酸檢測(cè)。

1.3 PCV-2 全基因序列擴(kuò)增與分析 參照文獻(xiàn)[6]建立的PCV-2 全基因序列PCR 擴(kuò)增方法，選取PCV-2 陽(yáng)性樣品擴(kuò)增其全基因序列，檢測(cè)PCR 產(chǎn)物，純化的PCR 產(chǎn)物與pMD-18T Vector 連接，然后轉(zhuǎn)化E.coli JM109 感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)PCR 鑒定后，送寶生物工程（大連）有限公司測(cè)定其核苷酸序列。應(yīng)用DNAStar 軟件對(duì)測(cè)定的序列與GenBank中收錄來(lái)自歐洲、美洲、亞洲以及中國(guó)的具有代表性毒株序列進(jìn)行同源性與進(jìn)化分析。引物序列及擴(kuò)增片斷大小見表1。

表1 引物序列及其擴(kuò)增片斷

PCR 反應(yīng)體系為50 μL，體系組成如下：2×GC BufferⅠ25.0 μL、滅菌ddH2O 10.5 μL、dNTP Mixture（2.5 mmol/L）8.0 μL、LA Taq（5U/μL）0.5 μL、PCV-2 QC-F（20 μmol/L）1.0 μL、PCV-2 QC-R（20 μmol/L）1.0 μL、DNA 4.0 μL。

反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，56 ℃退火50 s，72 ℃延伸1min，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。取5 μL PCR 產(chǎn)物用于電泳檢測(cè)。1.4 數(shù)據(jù)處理 采用SSPS17.0 處理數(shù)據(jù)，做卡方檢驗(yàn)及F 檢驗(yàn)，分析組間差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 遼寧豬群PCV2 流行情況

2.1.1 臨床發(fā)病豬群組織樣品PCV-2 核酸檢測(cè)結(jié)果 2008-2012 年對(duì)來(lái)自遼寧地區(qū)3336 份門診病例豬組織樣品進(jìn)行PCV-2 核酸檢測(cè)，平均陽(yáng)性率為58.99%，分別對(duì)不同年度、地域及全省總體陽(yáng)性率情況進(jìn)行卡方檢驗(yàn)分析，不同年度間全省、遼中、遼北及遼東地區(qū)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），而遼南、遼西地區(qū)漸近性差異顯著（P=0.028；P=0.006）；2008-2012 年各年度不同地域間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）（表2）。

2.1.2 臨床健康豬群組織樣品PCV-2 核酸檢測(cè)結(jié)果

2010-2013 年采自屠宰場(chǎng)的930 份豬組織樣品進(jìn)行核酸檢測(cè)，總體陽(yáng)性率為64.07%；其中，2010-2013年核酸陽(yáng)性率分別為44.29%、55.11%、72.80%和85.67%（表3）；呈逐年上升趨勢(shì)，統(tǒng)計(jì)分析表明，各年度核酸陽(yáng)性率漸近性差異顯著（P=0.014）。

表2 不同地區(qū)臨床發(fā)病豬組織病料PC V-2核酸檢測(cè)陽(yáng)性率

表3 臨床健康豬組織樣品PC V-2核酸檢測(cè)陽(yáng)性率

2.2 PCV-2 全基因組的擴(kuò)增與序列測(cè)定分析

2.2.1 PCV-2 全基因組的擴(kuò)增與序列測(cè)定 應(yīng)用擴(kuò)增PCV-2 全基因序列的PCR 引物，分別從組織病料和細(xì)胞培養(yǎng)物中擴(kuò)增到位于2 000 bp 附近特異條帶，與預(yù)期大小相符（圖1）。應(yīng)用病毒分離鑒定和PCR 擴(kuò)增方法，最終得到11 株遼寧毒株（以下簡(jiǎn)稱LN-PCV-2 毒株）的全基因序列，其中2012 年6 株，2013 年5 株（表4）；測(cè)序結(jié)果表明，其長(zhǎng)度為1 767 或1 768 bp。

圖1 LN-PC V-2毒株全基因序列擴(kuò)增結(jié)果

表4 2012年和2013年LN-PC V-2毒株

2.2.2 PCV-2 全基因組序列分析 應(yīng)用DNAStar軟件，將11 株LN-PCV-2 毒株全基因序列同選自GenBank 中收錄來(lái)自歐洲、美洲、亞洲以及中國(guó)的具有代表性的19 株P(guān)CV-2 毒株（國(guó)外11 株，國(guó)內(nèi)8 株）進(jìn)行同源性與進(jìn)化分析。結(jié)果表明，11 株LN-PCV-2 毒株之間同源性為94.5%～99.4%；2012 年6 株LN-PCV-2 毒株間同源性為95.4%～99.4%，2013 年5 株LN-PCV-2 毒株間同源性為95.2%～99.3%；遼東地區(qū)2 株間同源性為98.2%，遼南地區(qū)2 株間同源性為95.9%，遼西地區(qū)2 株間同源性為96%，遼北地區(qū)3 株間同源性為95.7%、95.1%和98.5%，遼中地區(qū)2 株間同源性為95.1%。

與國(guó)內(nèi)毒株相比，與處于同一地理區(qū)域的東北PCV-2 毒株同源性為95.3%～99.4%；與毗鄰的華北地區(qū)PCV2 毒株間同源性為94.6%～99.6%；與華東、華南、華中、西北和西南PCV2 毒株間同源性分別為94.8%～99.7%、95.2%～99.3%、94.5%～96.5%、94.6%～99.5%和94.8%～99.4%。

與國(guó)外PCV-2 毒株間同源性為94.3%～99.3%，其中，與歐洲PCV-2 毒株間同源性為95%～98.4%，與美洲PCV-2 毒株間同源性為94.3%～99.3%，與同處于亞洲朝鮮半島PCV-2 毒株間同源性為94.5%～96.6%；在國(guó)外毒株中，與法國(guó)PCV-2 毒株同源性相對(duì)較高（95.4%～99.3%），而與加拿大的PCV-2 毒株同源性相對(duì)較低（94.3%～97%）。

根據(jù)Olvera 等[7]分型標(biāo)準(zhǔn)，11 株LN-PCV-2 毒株中有9株屬于PCV-2b基因型，其中屬1A/1B亞群（型）7 株，1C亞群（型）2 株；另2 株屬于PCV-2a 基因型。按年度分布，2012 年6 株P(guān)CV-2 毒株中，PCV-2b 基因型1A/1B 亞群4 株，另2 株為PCV-2a 基因型；2013年5 株P(guān)CV-2 毒株中，PCV-2b 基因型1A/1B 亞群3株，PCV-2b 基因型1C 亞群2 株。按地域分布，遼東地區(qū)2 株，均屬于PCV-2b 基因型1A/1B 亞群；遼南地區(qū)2 株，分別屬于PCV-2b 基因型1A/1B 亞群和1C亞群；遼西地區(qū)2 株，分別屬于PCV-2b 基因型1A/1B亞群和1C 亞群；遼北地區(qū)3 株，PCV-2b 基因型1A/1B 亞群2 株，PCV-2a 基因型1 株，遼中地區(qū)2 株，分別屬于PCV-2b基因型1A/1B亞群和PCV-2a基因型。

3 討論

3.1 英國(guó)于1993 年首次暴發(fā)由PCV-2 感染引起的PDNS，自1999 年后，PMWS 在英國(guó)呈上升 趨勢(shì)，平均發(fā)病率為25%，而最高可達(dá)40%，由其造成的經(jīng)濟(jì)損失比豬瘟和口蹄疫還要大[8]。張志等[9]調(diào)查表明，國(guó)內(nèi)豬群PCV-2 感染率逐年攀升，最高達(dá)90%以上，屠宰場(chǎng)采集的組織樣品也高達(dá)60%。通過(guò)對(duì)遼寧省臨床發(fā)病和臨床健康豬群的組織樣品進(jìn)行檢測(cè)，平均陽(yáng)性率分別為58.99%和53.81%，且呈逐年上升趨勢(shì)，表明在遼寧地區(qū)豬群中普遍存在PCV-2 感染，污染面逐年擴(kuò)大。分析比對(duì)臨床發(fā)病豬群與臨床健康豬群檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，臨床健康豬群PCV-2 陽(yáng)性率與臨床發(fā)病豬群相當(dāng)，進(jìn)一步證實(shí)了PCV-2 有隱性感染的特點(diǎn)，遼寧地區(qū)臨床健康豬群中有大量的PCV-2 隱性感染或/和亞臨床感染豬，應(yīng)引起足夠的重視。

3.2 全基因序列同源性分析表明，不同年度、不同地域毒株全基因序列的同源性較高，表明近2年來(lái)遼寧流行的PCV-2 毒株沒有明顯的空間和時(shí)間特征，而且，至少存在3 個(gè)亞型，PCV-2b 為主要流行基因型；同一時(shí)期遼寧豬群中存在著不同進(jìn)化階段的PCV-2 毒株流行，與文獻(xiàn)報(bào)道的國(guó)內(nèi)其他地區(qū)情況也基本一致[10]。11 株LN-PCV-2 毒株與國(guó)內(nèi)、外PCV-2 毒株變異程度均不大，表明PCV-2 流行毒株沒有地域意義。由基于全基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹可知，11 株LN-PCV-2 毒株散布于兩大基因型中，其分散程度與19 株國(guó)內(nèi)外PCV-2 參考毒株相當(dāng)，表明國(guó)內(nèi)PCV-2 毒株來(lái)源可能較廣泛，一些可能由美國(guó)、加拿大等國(guó)傳入；另一部分可能源于歐洲，但這一觀點(diǎn)還需通過(guò)分析更多PCV-2 毒株序列進(jìn)一步證實(shí)；同時(shí)，也表明遼寧豬群中PCV-2 流行情況比較復(fù)雜。

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