王宏棟，徐國鋒，矯薇薇，張秀英

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150030）

在過去相當(dāng)長的一段時(shí)間里，人們一直認(rèn)為細(xì)菌對氟喹諾酮類耐藥機(jī)制主要是由染色體耐藥決定區(qū)[1]（quinolone resistance determining regions，QRDRs）突變造成的，并通過自我復(fù)制垂直傳遞給子代，但是這卻不能解釋臨床上耐藥性在不同細(xì)菌平行傳播的現(xiàn)象。隨著研究的深入，1998 年Martínez-Martínez[2]等人首次在美國分離到了攜帶多重耐藥質(zhì)粒pMG252 的肺炎克雷伯氏菌，并報(bào)道了質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類藥物耐藥性，截止到目前為止，已有3 大類PMQR 基因（qnr、aac（6′）-Ib-cr、qepA）在世界范圍內(nèi)報(bào)道[2-5]。

為了解質(zhì)粒介導(dǎo)氟喹諾酮類耐藥基因在哈爾濱地區(qū)豬源大腸桿菌中的流行情況，本文通過設(shè)計(jì)特異性引物對哈爾濱地區(qū)分離得到的豬源大腸桿菌進(jìn)行PMQR 基因的檢測與分析，旨在了解質(zhì)粒介導(dǎo)氟喹諾酮類耐藥基因的流行情況，重點(diǎn)研究同一臨床分離株是否同時(shí)攜帶不同的PMQR 基因，從而指導(dǎo)臨床合理應(yīng)用氟喹諾酮類藥物，為抑制其耐藥性的產(chǎn)生與傳播奠定基礎(chǔ)。

1 材料

菌株：大腸桿菌質(zhì)控菌株ATCC25922，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；大腸桿菌臨床分離株分離自哈爾濱市周邊規(guī)?；B(yǎng)豬場豬肛拭子（放置冰盒）。試劑：麥康凱培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基等實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基以及腸桿菌科生化鑒定管等，均購自杭州天和微生物試劑有限公司；2×Tap PCR Mix、DL-2 000DNA Marker，購自TaKaRa 公司。藥品：慶大霉素（CN）、阿米卡星（AMK）、恩諾沙星（ENR）、環(huán)丙沙星（CIP）、頭孢曲松（CRO）、頭孢曲松-舒巴坦（CRO-SCF）、多西環(huán)素（DOX）、氟苯尼考（FLO），均購自北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司。

2 方法

2.1 分離和純化 從哈爾濱周邊地區(qū)采集得到的肛拭子進(jìn)行增菌培養(yǎng)，根據(jù)Domínguez 等[5]介紹方法，將菌液接種到麥康凱瓊脂培養(yǎng)基中，挑取符合大腸桿菌形態(tài)的粉紅色圓形單菌落于伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行純化培養(yǎng)，挑取黑色具金屬光澤單菌落于LB 瓊脂平板上37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取單菌落于LB 液體培養(yǎng)基中進(jìn)行增菌培養(yǎng)。

2.2 鑒定 取少量上述疑似大腸桿菌菌液進(jìn)行革蘭染色，鏡檢，將符合大腸桿菌形態(tài)的菌體采用生化鑒定管(包括葡萄糖、賴氨酸、鳥氨酸等10 項(xiàng)生化試驗(yàn))進(jìn)行鑒定，大腸埃希菌ATCC25922做陽性對照。

2.3 藥物最小抑菌濃度（MIC） 采用美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（CLSI）所推薦的微量肉湯稀釋法進(jìn)行，并根據(jù)CLSI 標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行藥物敏感性判斷。

2.4 質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類藥物耐藥（PMQR）基因的檢測

2.4.1 模板質(zhì)粒的提取 依照離心柱型質(zhì)粒小量提取試劑盒說明書進(jìn)行大腸桿菌模板質(zhì)粒的提取，并將其置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4.2 引物的設(shè)計(jì)與擴(kuò)增 根據(jù)GenBank 已知序列和參考文獻(xiàn)[6]設(shè)計(jì)9 對特異性引物，由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。PCR 反應(yīng)體系為菌液質(zhì)粒為模板（1 μL），2×Tap PCR Mix 為10 μL，ddH2O 為7 μL，上下游引物各1 μL。PMQR基因的反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變形5 min，95 ℃變形30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共30 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸7 min，4 ℃保存，PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。將陽性擴(kuò)增產(chǎn)物，選取部分送英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司進(jìn)行測序，利用NCBI blast 程序在GenBankTM中對目的基因序列進(jìn)行同源檢索分析。aac（6′）-Ib 測序結(jié)果利用DNASTAR 與已知野生型aac-（6′）-Ib 的氨基酸序列進(jìn)行比對，看其氨基酸是否存在102 位（Trp-Arg）和109 位（Asp-Tyr）的突變。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 分離、純化與鑒定 78 份樣本中共分離純化出67 株疑似大腸桿菌，在麥康凱培養(yǎng)基上呈粉紅色，在伊紅美蘭培養(yǎng)基上呈深紫色、金屬光澤，顯微鏡下菌體呈兩端鈍圓革蘭染色陰性，經(jīng)過生化鑒定管確定為大腸桿菌。

3.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 8 種被測藥物的藥敏試驗(yàn)結(jié)果和多重耐藥情況分別見圖1 和圖2。

圖1 67株豬源大腸桿菌對8種抗菌藥的耐藥率

3.3 PMQR 基因的PCR 檢測 PMQR 基因型分型結(jié)果見表1，PCR 電泳圖見圖3-8，在67 株受試大腸桿菌中，62（92.54%）株至少攜帶一種的PMQR 基因，oqxAB 檢出率最高（47 株、70.15%），其次是qnrS（43株、64.18%）、aac（6′）-Ib-cr（15 株、22.39%）、qnrB（9株、13.43%）、qepA（8株、11.94%），qnrA、qnrC、qnrD在本次研究中并未檢出。

4 討論

圖2 67株豬源大腸桿菌的多重耐藥率

4.1 耐藥性分析 本研究所調(diào)查的67 株大腸桿菌對8 種臨床常用抗菌藥物均存在一定的耐藥性，且多呈現(xiàn)多重耐藥，3耐及3耐以上的菌株占到97.01%，這與本課題組前期研究報(bào)道[7]的豬源大腸桿菌多重耐藥率達(dá)100%是相一致的。受試菌株對氟苯尼考的耐藥率已經(jīng)達(dá)到了71.64%，對多西環(huán)素耐藥率為41.8%，結(jié)果與其他文獻(xiàn)[8]的報(bào)道相似；對頭孢曲松的耐藥率為100%，高于國內(nèi)其他報(bào)道[9]；對氟喹諾酮類藥物恩諾沙星（31.34%）、環(huán)丙沙星（16.42%）的耐藥率與分離自我國健康動(dòng)物的大腸桿菌耐藥率[11]相類似，但低于國內(nèi)患病動(dòng)物的相關(guān)報(bào)道[10]，分析耐藥率與其他研究報(bào)道差異的原因可能是不同的地區(qū)，豬場臨床用藥習(xí)慣的差異造成的。

圖3 acc（6′）Ib基因PC R 結(jié)果

圖4 oqxB 基因PC R 結(jié)果

圖5 oqxA 基因PC R 結(jié)果

圖6 qepA 基因PC R 結(jié)果

圖7 qnrS 基因PC R 結(jié)果

圖8 qnrB 基因PC R 結(jié)果

表1 PM Q R 陽性菌株基因型分型

4.2 PMQR 基因調(diào)查情況 自1998 年世界上首次報(bào)道從阿拉巴馬州分離的肺炎克雷伯菌含有qnrA基因以來，世界范圍內(nèi)的PMQR 基因的流行病學(xué)就逐漸發(fā)展起來。本研究調(diào)查了從哈爾濱周邊地區(qū)規(guī)?；B(yǎng)豬場分離得到的67 株豬源大腸桿菌中PMQR 基因的流行情況，發(fā)現(xiàn)92.54%至少含有一種PMQR 基因，各個(gè)PMQR 基因的檢出率也明顯高于國內(nèi)其他文獻(xiàn)報(bào)道[12]，這也揭示了隨著氟喹諾酮類藥物的使用，PMQR 基因的流行率有升高的趨勢，其中oqxA 和oqxB 檢出率最高（70.15%），qnr 各亞型中，qnrS 最常見，這一結(jié)果與國內(nèi)其他文獻(xiàn)報(bào)道是一致的[13]，然而之所以對氟喹諾酮類藥物恩諾沙星（31.34%）、環(huán)丙沙星(16.42%)的耐藥率低于國內(nèi)患病動(dòng)物的相關(guān)報(bào)道[10]，分析原因可能是所調(diào)查的豬場近年來未使用這兩種抗菌藥物，PMQR 基因處于低水平表達(dá)，未達(dá)到具有臨床意義的氟喹諾酮類藥物耐藥。

5 結(jié)論

本研究對哈爾濱地區(qū)豬源大腸埃希菌的耐藥性進(jìn)行了測定，結(jié)果顯示耐藥性嚴(yán)重，且多呈現(xiàn)多重耐藥；通過PCR 方法，可以發(fā)現(xiàn)PMQR 基因的檢出率已達(dá)到很高的程度。哈爾濱地區(qū)豬源大腸埃希菌對臨床常用藥物的耐藥性不斷增強(qiáng)，已成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。雖然qnr、qepA、aac（6′）-Ib-cr 僅介導(dǎo)低水平的氟喹諾酮類藥物耐藥性，但是較高檢出率以及共同存在，也將有助于選擇出高水平的氟喹諾酮類藥物耐藥性，因此非常有必要進(jìn)行大腸桿菌耐藥性分析以及質(zhì)粒介導(dǎo)氟喹諾酮類藥物耐藥基因的檢測，檢測耐藥情況和PMQR 基因的流行情況，將有助于指導(dǎo)臨床合理用藥，延緩或抑制耐藥性的發(fā)生，也為耐藥質(zhì)粒的消除提供廣闊的思路。

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