王榮梅，趙翠燕，閆文龍，陳立軍

（1.韶關(guān)學(xué)院英東農(nóng)業(yè)科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 韶關(guān)512005 ；2.廣西出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣西 南寧530021）

高劑量銅作用于肉雞會(huì)導(dǎo)致其銅中毒，已有研究表明，高銅會(huì)導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生活性氧分子（ROS），而ROS 能夠引起脂質(zhì)過氧化損傷，線粒體型硫氧還蛋白2 系統(tǒng)（Trx2 系統(tǒng)）對(duì)清除體內(nèi)自由基具有重要作用，它是一種存在于線粒體中的抗氧化系統(tǒng)，該系統(tǒng)為一個(gè)控制細(xì)胞還原/氧化狀態(tài)和細(xì)胞增殖/生存的廣泛表達(dá)的氧化還原系統(tǒng)，在線粒體內(nèi)行使多種生物學(xué)功能[1]。線粒體型硫氧還蛋白2（Trx2）是該系統(tǒng)的組成成分之一，它是Trx 家族中一種線粒體特異性蛋白，它與錳型超氧化物岐化酶（Mn-SOD）以及還原型谷胱甘肽（GSH）構(gòu)成線粒體重要的抗氧化防御系統(tǒng)[2]。本課題組之前的研究表明高銅日糧可導(dǎo)致線粒體硫氧還蛋白還原酶2 mRNA 在肝臟中的表達(dá)量降低，還原活性先升高后降低[3]。本試驗(yàn)旨在探討高銅日糧對(duì)肉雞肝臟Trx2 在基因表達(dá)和蛋白表達(dá)方面的影響，以更進(jìn)一步研究高銅對(duì)動(dòng)物肝臟線粒體抗氧化功能的損傷機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 選用1 日齡Cobb 商品代肉雞200只（購(gòu)自深圳某種雞場(chǎng)，平均體質(zhì)量36 g±0.3 g），隨機(jī)分為4 組，每組50 只。對(duì)雞進(jìn)行常規(guī)免疫，自由采食和飲水，24 h 光照。試驗(yàn)選用CuSO4·5H2O作為銅源，基礎(chǔ)日糧對(duì)照組銅含量為Feedstuff 推薦的11 mg/kg（對(duì)照組，即Ⅰ組），高銅試驗(yàn)組分別為此標(biāo)準(zhǔn)的10、30 倍和50 倍，即110 mg/kg（Ⅱ組）、330 mg/kg（Ⅲ組）、550 mg/kg（Ⅳ組）?；A(chǔ)日糧以玉米、豆粕為主配制而成，蛋白質(zhì)、能量以及維生素和微量元素添加量均按照NRC（1994）家禽營(yíng)養(yǎng)需要配制。

1.2 主要試驗(yàn)材料 凝膠成像及分析系統(tǒng)（美國(guó)Perkin-Elmer 公司）；高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Thermo IEC 公司）；PCR 儀（美國(guó)Perkin-Elmer 公司）；微量移液器（法國(guó)GILSON 公司）；BG-verMINI 迷你垂直電泳儀和BG-blotMINI 迷你垂直轉(zhuǎn)移槽（美國(guó)BAYGENE 公司）；TS-2 型脫色搖床（海門其林貝爾儀器制造有限公司）；手動(dòng)勻漿器、RTPCR 試 劑 盒（TaKaRa PrimeScript One Step RTPCR Kit Ver.2）；Trx2 鼠單抗（英國(guó)Abcam 公司）；羊抗鼠IgG-HRP（南京生興生物公司）；GAPDH 標(biāo)簽抗體（36 kD）（康為世紀(jì)公司）。

1.3 樣品采集 于試驗(yàn)的10 d、30 d 和50 d 每組隨機(jī)選擇5 只雞宰殺、采集肝臟，單只肝臟一部分放入液氮中保存用于提取肝臟總RNA，另一部分置液氮中迅速冷凍，再置于-70 ℃保存，用于提取肝臟總蛋白以測(cè)定肝臟中Trx2 蛋白表達(dá)量。

1.4 肉雞肝臟總RNA 的提取和測(cè)定 總RNA 提取按TaKaRa 公司的RNAiso Plus 試劑盒進(jìn)行。紫外比色法測(cè)定總RNA 濃度和純度，取10μg 總RNA，變性瓊脂糖凝膠電泳分離、拍照觀察RNA條帶。

1.5 PCR 引物的設(shè)計(jì)及RT-PCR 反應(yīng) 目的基因引物序列是根據(jù)GenBank 上雞的Trx2、cDNA 序列按Primer6 軟件自行設(shè)計(jì)的，引物序列見表1，由上海博亞工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 目的基因引物參數(shù)

參照TaKaRa 有限公司的One Step primeScript RT-PCR Kit Ver.2 操作說明書進(jìn)行RT-PCR 反應(yīng)。反應(yīng)體系中模板即總RNA 為2 μg；經(jīng)過多次條件優(yōu)化、選擇后，最終確定本試驗(yàn)反應(yīng)條件為50 ℃30 min，94 ℃3 min，94 ℃30 s（變性），56 ℃40 s（退火），72 ℃50 s（延伸），3～5 步循環(huán)39次，72 ℃10 min。Trx2 和β-actin 目的基因的退火溫度為56 ℃。

1.6 DNA 片段回收及測(cè)序 將鑒定準(zhǔn)確的PCR產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，然后按TaKa-Ra Agarose Gel DNA Purification Kit Ver. 2.0 操作說明書將DNA 片段進(jìn)行回收，送寶生物工程（大連）有限公司測(cè)序。

1.7 PCR 擴(kuò)增、電泳及灰度分析 按上述條件進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增所要測(cè)定樣品，取單個(gè)樣品PCR 產(chǎn)物5 μL 在1.5% 瓊脂糖凝膠上電泳（EB 染色）。用Quanty One 圖像分析軟件系統(tǒng)分析條帶灰度。目的基因條帶灰度與β-actin 條帶灰度的比值來(lái)表示Trx2目的基因豐度，亦即試驗(yàn)結(jié)果。每組5 個(gè)樣品，每個(gè)樣品做2 次重復(fù)。

1.8 Trx2 蛋白表達(dá)的測(cè)定 細(xì)胞裂解法提取肝臟組織總蛋白，考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定，SDS-PAGE 凝膠電泳，Western blot 蛋白印跡，用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描并進(jìn)行灰度分析。每組目的蛋白條帶吸光度（N）與相應(yīng)的GAPDH 蛋白條帶吸光度（A）的比值Y(Y=N/A)作為Trx2 蛋白表達(dá)的相對(duì)含量，亦即試驗(yàn)結(jié)果。每組5 個(gè)樣品，每個(gè)樣品做2 次重復(fù)。

1.9 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)用-X ±SE 表示，應(yīng)用SPSS 統(tǒng)計(jì)分析軟件統(tǒng)計(jì)各組的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，通過Ducans 新復(fù)極差檢驗(yàn)法（DMRT 法）比較組間的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 高銅日糧對(duì)肉雞Trx2 基因mRNA 表達(dá)的影響 組間比較，與對(duì)照組（Ⅰ組）相比，在對(duì)應(yīng)試驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)，除Ⅳ組50 d 時(shí)Trx2 mRNA 基因表達(dá)量降低，且差異顯著（P＜0.05）外，其余組在各試驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組相比雖略有升高，但差異不顯著（P＞0.05）；組內(nèi)比較，Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組在30 d、50 d 較該組10 d 時(shí)Trx2 mRNA 基因表達(dá)量升高，但差異不顯著（P＞0.05），Ⅳ組30 d、50 d 較該組10 d 時(shí)Trx2 mRNA 基因表達(dá)量降低，且50 d 時(shí)差異顯著（P＜0.05），結(jié)果見表2。

2.2 高銅日糧對(duì)Trx2 蛋白表達(dá)的影響 組間比較，與對(duì)照組（Ⅰ組）相比，在對(duì)應(yīng)試驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)，Ⅳ組50d 時(shí)Trx2 蛋白表達(dá)量升高，且差異顯著（P＜0.05），其余組在各試驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組相比雖略有升高，但差異不顯著（P＞0.05）；組內(nèi)比較，Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組在30 d、50 d 較該組10 d 時(shí)Trx2 蛋白表達(dá)量均升高，但只有50 d 時(shí)差異顯著（P＜0.05），結(jié)果見表3。

表2 高銅日糧對(duì)Trx2基因mRNA表達(dá)的影響

表3 高銅日糧對(duì)Trx2蛋白表達(dá)的影響

3 討論

ROS 在啟動(dòng)和調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡中扮演重要角色[4]，機(jī)體不斷形成的低水平ROS 是正常氧代謝的部分產(chǎn)物[5-6]，然而當(dāng)ROS 產(chǎn)生增加或保護(hù)系統(tǒng)功能降低時(shí)會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激，大分子不可逆性損傷、琉基氧化，引起病理過程包括凋亡[7]?；钚匝跻环矫嬖谏矬w內(nèi)發(fā)揮著重要的生理功能，同時(shí)在一定條件下有成為損害生物機(jī)體的內(nèi)在因子，誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能損害。高銅作用于肝臟細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的ROS，ROS 攻擊損傷細(xì)胞線粒體DNA（mtDNA）。mtDNA 編碼13 條多肽均為氧化磷酸化酶復(fù)合體的亞基，在線粒體呼吸鏈電子傳遞和氧化磷酸化產(chǎn)能過程中發(fā)揮重要作用[8]。mtDNA損傷致使線粒體電子傳遞障礙和三磷酸腺苷（ATP）能量合成障礙，電子漏產(chǎn)生增加，生成大量ROS，加重靶細(xì)胞損傷[9]。由此可知，線粒體既是細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的主要部位又是氧化損傷的主要靶細(xì)胞器[10]。因此，如何早期提高抗氧化能力、加強(qiáng)對(duì)線粒體保護(hù)、減少ROS 產(chǎn)生[11]是降低高銅日糧對(duì)肉雞肝臟損傷的關(guān)鍵。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，采用高銅日糧飼喂試驗(yàn)雞后，Trx2 的mRNA 表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平在不同組別不同時(shí)期有一定的變化趨勢(shì)。Ⅰ、Ⅱ組隨著試驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)Trx2 的蛋白表達(dá)量升高，但差異不顯著（P＞0.05），同樣該兩組基因表達(dá)量也升高，差異不顯著（P＞0.05），說明飼料中銅含量在110 mg/kg 時(shí)能夠提高肝臟Trx2 的基因和蛋白表達(dá)量，從而增強(qiáng)肝臟的抗氧化性能、提高線粒體體呼吸功能，提高肉雞的生長(zhǎng)性能。Ⅲ組、Ⅳ組在30 d 和50 d 時(shí)蛋白表達(dá)量升高，且50 d 時(shí)差異顯著（P＜0.05），但Ⅲ組基因表達(dá)量一直升高，Ⅳ組基因表達(dá)量降低且50 d 時(shí)差異顯著（P＜0.05），由此表明，當(dāng)日糧銅含量在550 mg/kg 飼喂50 d 時(shí)，Trx2 mRNA 基因表達(dá)量降低、蛋白表達(dá)量升高，提示高銅會(huì)影響Trx2 基因表達(dá)及蛋白表達(dá)過程，原因可能是因?yàn)闄C(jī)體具有代償作用，日糧銅含量為330 mg/kg～550 mg/kg 飼喂一段時(shí)間以后（30 d～50 d 左右）肝臟受到損害，結(jié)合本課題組之前的研究結(jié)果[3]，銅作用下線粒體中的抗氧化系統(tǒng)功能降低，機(jī)體為了抵抗高銅帶來(lái)的損傷而代償性的提高硫氧還蛋白還原酶2（TrxR2）的活性，以大量還原氧化型Trx2 而達(dá)到修復(fù)肝臟Trx2 系統(tǒng)的作用，但是，銅同樣可抑制Trx2 的基因表達(dá)，導(dǎo)致其基因表達(dá)量降低，機(jī)體為了達(dá)到清除越來(lái)越多的ROS 的目的，在TrxR2 活性的作用下，Trx2 蛋白表達(dá)量升高。

[1] Steph E N，Byung H H，Ning L L，et al.Selective vulnerability of late oligodendrocyte progenitors to hypoxiaischemia[J].J Neurosci，2002，22（2）:455-463.

[2] 蔡成，常立文，李文斌.高氧對(duì)人肺腺癌A549 細(xì)胞中硫氧還蛋白-2 表達(dá)的影響[J].華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2008，37（2）:222-228.

[3] 劉好朋，唐兆新，蘇榮勝，等.高銅日糧對(duì)肉雞TrxR2 基因mRNA 表達(dá)和還原活性的影響[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2011，42（3）:423-428.

[4] Anantharam V，Lehrmann E，Kanthasamy A，et al . Mieroarray analysis of oxidative stress regulated genes mesencephalic dopaminergic neuronal cells：Relevance oxidative damage in Park inson‘S disease[J].Neur Ochem Int，2007，50（6）:834-847.

[5] Chance B，Sies H，Boveris A.Hydroperoxide metabolism in mammalian or Pgans[J].Phsiol Rev，1979，59（3）:527-605.

[6] Cadenas E.Biochemistry of oxygen toxicity[J].Annu Rev Biochem，1985，5:79-110.

[7] Zhivolovsky B，Orrenjus S，Brustugun O T，et al.Injrted cytochrome c induces apoptosis[J].Nature，1998，391（66）:449-500.

[8] Xu W，Ngo L，Perez G，et al.Intrinsic apoptoticc and thioredoxin pathways in human Prostate cancer cell response to histone deacetylase inhibitor[J].Proc Natl Acad Sci USA，2006，103（42）:15540-15545.

[9] Wang D，Masutani H，Oka S，el al.Control of mitoehondrial outer membrane permea Bilization and Bcl-xL levels by thioredoxin 2 in DT40 cells[J].J Biol Chem，2006，281（11）:73 84-7391.

[10] Beard D A.A biophysical model of the mitochondrial respiratory system and oxidative Phosphorylation[J].PLoS Comput Biol，2005，1（4）:e36.

[11] Lo H L，Nakajima S，Ma L，et al.Differential biologic effects of CPD and 6-4PP UV-Induced DNA damage on the induction of apoptosis and cell-cycle arrest[J].BMC Cancer，2005，135（5）:1-9.