黃超華，張全紅，陳 坤，王永強(qiáng)，曹 紅，李曉齊，鄭世軍

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀100193 ；2.蛇口出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東 深圳518054；3.國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局專利局專利審查協(xié)作北京中心，北京 海淀100190）

雞傳染性貧血病毒（CIAV）作為雞傳染性貧血（CIA）的病原，主要引起感染雞再生障礙性貧血和雛雞的免疫抑制，繼而引發(fā)其他病原發(fā)生繼發(fā)感染。該病毒在世界范圍內(nèi)廣泛分布，對(duì)養(yǎng)雞業(yè)是一種潛在的巨大威脅。

雞傳染性貧血病毒（CIAV）屬于圓環(huán)病毒科。Noteborn 等人于1991 年對(duì)CIAV 的全基因組進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)其長(zhǎng)度為2.3 kb，含3 個(gè)開放閱讀框架（ORF），分別編碼VP1、VP2、VP3 等3 種病毒蛋白[1]。VP3 作為CIAV 的非結(jié)構(gòu)蛋白，是CIAV最主要的致病因子，能夠誘導(dǎo)感染雛雞骨髓造血細(xì)胞及胸腺的前T 細(xì)胞凋亡[2]，從而導(dǎo)致雛雞出現(xiàn)嚴(yán)重的出血、貧血及免疫抑制。同時(shí)，研究證實(shí)，VP3 能選擇性地誘導(dǎo)人轉(zhuǎn)化細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞凋亡，而對(duì)正常二倍體細(xì)胞無毒害作用[3]。因?yàn)檫@種特性，VP3 成為抗腫瘤藥物的研究熱點(diǎn)，被命名為“Apoptin”。研究表明，VP3 誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡不需要腫瘤抑制因子p53 的介導(dǎo)[4]，但依賴于caspase 的參與，尤其是caspase-3 的活化[5]。除此之外，人們通過各種技術(shù)手段找到了一些可能參與Apoptin 凋亡過程的蛋白，如孫敬國(guó)[6]等發(fā)現(xiàn)，ABP280、NMI、UPH 和MYB 等 結(jié) 合 蛋 白 可 以 與Apoptin 結(jié)合；Cheng[7]等也篩選到了幾種與Apoptin相互作用的蛋白，其中包括APAPI 和Hippi 等。這些蛋白都可能參與了Apoptin 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程。但是，Apoptin 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的具體途徑仍不清楚，需要進(jìn)一步的研究。本研究成功克隆到CIAV vp3 基因并成功構(gòu)建出真核表達(dá)載體pEGFP-VP3。后者可以在293 T 和BHK-21 細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)VP3 蛋白，并能誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，為深入研究CIAV 的致病機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 CIAV 病毒毒株與細(xì)胞 CIAV 病毒Cux-1 標(biāo)準(zhǔn)株由北京市農(nóng)林科學(xué)院楊兵副研究員提供，293 T 和BHK-21 細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑 Taq plus DNA 聚合酶、質(zhì)粒小量提取試劑盒、DNA 回收試劑盒，購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH5α、DNA Marker，購(gòu)自北京天為時(shí)代生物公司；限制性內(nèi)切酶、pMD18-T simple 連接試劑盒，購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；X-gal、IPTG 為Sigma 公司產(chǎn)品；質(zhì)粒大量提取試劑盒、真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒和化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自北京威格拉斯公司；真核表達(dá)載體pEGFP-N1 由本實(shí)驗(yàn)室保存。

此外，就該詩(shī)來說，華茲華斯并未滿足于母國(guó)曾對(duì)蘇格蘭的殖民壓迫，他甚至認(rèn)為未來還有同樣的事情發(fā)生。這不僅表明詩(shī)人對(duì)日不落帝國(guó)可以永遠(yuǎn)保持主體地位的渴望，同時(shí)也暗含其對(duì)蘇格蘭永恒他者地位的期許。無獨(dú)有偶，詩(shī)人的帝國(guó)憧憬在《紫杉樹》中也有較好的展示：

1.6 重組真核表達(dá)載體pEGFP-vp3 的構(gòu)建 將篩選出的上述陽性重組質(zhì)粒和真核表達(dá)載體pEGFP-N1 分別用Xho I 和BamH I 進(jìn)行雙酶切，電泳回收和純化DNA 片段后進(jìn)行連接和轉(zhuǎn)化，篩選陽性菌落，并進(jìn)行酶切和PCR 鑒定。

以pCMV-Myc-vp3 轉(zhuǎn)染293 細(xì)胞24 h 收獲細(xì)胞蛋白，進(jìn)行Western Blot 檢測(cè)。HSC70 蛋白作為細(xì)胞的內(nèi)參對(duì)照蛋白。

此 外，以pCMV-Myc-vp3 轉(zhuǎn) 染293 T 細(xì) 胞 后24 h，VP3-Myc 融合蛋白明顯表達(dá)（圖4），進(jìn)一步證實(shí)VP3 在細(xì)胞中成功表達(dá)。

1.3 引物設(shè)計(jì) 參考GenBank 中CIAV 病毒Cux-1標(biāo)準(zhǔn)株的基因組序列，應(yīng)用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物，分別在上下游引物中加入Xho I 和BamH I 兩個(gè)酶切位點(diǎn)，預(yù)期擴(kuò)增長(zhǎng)度為377 bp。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。上游引物：5′-CTC GAG ATC TCA AAT GAA CGC TC-3′；下游引物：5′-GGA TCC CGC AGT CTT ATA CGC C-3′。

連接鍋爐至文丘里冷卻器[3]（可利用原惰氣系統(tǒng)輔助冷卻器，需核算換熱量是否滿足）工藝管路。改在完成后，鍋爐產(chǎn)生尾氣，進(jìn)入冷卻器冷卻，通過增壓風(fēng)機(jī)增壓后進(jìn)入大艙做為覆蓋氣。增加兩路電動(dòng)控制閥用于在熱介質(zhì)鍋爐尾氣流程下游發(fā)生故障時(shí)進(jìn)行閥門切換，以保證鍋爐尾氣可以順利排放至大氣，穩(wěn)定鍋爐運(yùn)行。具體工藝如圖1。

1.7 重組真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-vp3 在真核細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá) 將鑒定為陽性的質(zhì)粒，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，并根據(jù)質(zhì)粒提取試劑盒的說明，大量提取重組真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-vp3。隨后，按照真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒提供的步驟將重組真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-vp3 轉(zhuǎn)染BHK-21 和293T 細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染24 h 后，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光；同時(shí)提取細(xì)胞總RNA，進(jìn)行RT-PCR。從而確定重組真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-vp3 的瞬時(shí)表達(dá)情況。在pCMV-Myc-vp3 轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h 后，收取細(xì)胞通過常規(guī)Western Blot，檢測(cè)VP3 蛋白表達(dá)情況，HSC 70作為內(nèi)參考對(duì)照細(xì)胞蛋白。

2.2 pEGFP-vp3 瞬時(shí)表達(dá)的RT-PCR 結(jié)果 轉(zhuǎn)染后24 h，提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞的總RNA，并進(jìn)行RTPCR。從結(jié)果可以看到均能從轉(zhuǎn)染pEGFP-vp3 的293T 細(xì)胞和BHK-21 細(xì)胞的RNA 中擴(kuò)增出特異的DNA 條帶，大小為377 bp 左右，與預(yù)期的VP3基因一致（見圖2）。其中198 bp β-actin 為參照。這說明轉(zhuǎn)染了pEGFP-vp3 的293T 細(xì)胞和BHK-21細(xì)胞均能轉(zhuǎn)錄出vp3 的mRNA。

2 結(jié)果

2.1 CIAV vp3 基因的擴(kuò)增和克隆與真核表達(dá)載體的構(gòu)建 以提取的CIAV DNA 為模板，利用CIAV vp3 特異引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，其產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳顯示大小約為377 bp，與預(yù)期大小一致（見圖1 A）。將vp3 PCR 產(chǎn)物插入克隆載體pMD18-T simple vector，并對(duì)重組克隆質(zhì)粒pMD-vp3 進(jìn)行PCR 和酶切鑒定和測(cè)序，發(fā)現(xiàn)與GenBank 發(fā)表的雞傳染性貧血病毒Cux-1 標(biāo)準(zhǔn)株的vp3 基因同源性在99.8%以上，說明克隆片段為vp3 基因序列。將提取的重組真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-vp3 進(jìn)行PCR 和酶切鑒定：擴(kuò)增出4 700 bp 和377 bp 的兩條帶（見圖1B）。結(jié)果表明，目的片段vp3 基因已成功地插入到真核表達(dá)載體pEGFPN1 上。同樣，pCMV-Myc-vp3 也構(gòu)建成功。

圖1 vp3基因的克隆和真核表達(dá)載體pEG FP-vp3的構(gòu)建

1.8 臺(tái)盼藍(lán)染色實(shí)試驗(yàn) 采用臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)細(xì)胞活力。設(shè)計(jì)3 組實(shí)驗(yàn)，分別為空白對(duì)照組（control 組）、空載體對(duì)照組（pEGFP-N1 組）和pEGFP-vp3 組。分別于轉(zhuǎn)染后24 h、48 h、72 h、96 h、120 h 收集293T 細(xì)胞，并制備成密度為105個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液，1∶1 加入0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色液，作用3 min，立即在普通光學(xué)顯微鏡下用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。細(xì)胞核藍(lán)染的，為死亡細(xì)胞，結(jié)果以細(xì)胞死亡率（細(xì)胞死亡率=死亡細(xì)胞數(shù)/死亡細(xì)胞+活細(xì)胞數(shù)）表示。結(jié)果組間差異用t-檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05 為差異顯著。

圖2 pEG FP-vp3瞬時(shí)表達(dá)的R T-PC R 結(jié)果

2.3 pEGFP-vp3 瞬時(shí)表達(dá)的熒光觀察以及Western Blot 檢測(cè) 轉(zhuǎn)染24 h，在倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pEGFP-vp3 的293T細(xì)胞和BHK-21 細(xì)胞均能產(chǎn)生清晰的熒光。將轉(zhuǎn)染了pEGFP-vp3 的細(xì)胞與轉(zhuǎn)染了pEGFP-N1 空載體的細(xì)胞進(jìn)行比較，可以發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pEGFP-vp3 的細(xì)胞的熒光聚集成顆粒狀且固定在一定區(qū)域，而后者的熒光則彌散在整個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中（見圖3）。這可能與VP3 蛋白的特性相關(guān)，在細(xì)胞中表達(dá)的VP3 蛋白常常以細(xì)小的顆粒存在，有時(shí)還形成相對(duì)較大的球狀顆粒。這說明真核表達(dá)載體pEGFP-vp3 可以表達(dá)融合綠色熒光蛋白的VP3 蛋白。

圖3 pEG FP-vp3瞬時(shí)表達(dá)的熒光觀察結(jié)果 （200×）

1.5 擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆和測(cè)序 按照連接試劑盒說明書，將回收PCR 產(chǎn)物與pMD18-T simple vector 進(jìn)行連接，1 h 后轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli.DH5α，涂布于含氨芐青霉素（100 IU/mL）和X-gal IPTG 的LB培養(yǎng)板，于37 ℃培養(yǎng)過夜，挑取白色菌落后過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，將酶切和PCR 鑒定為陽性的重組質(zhì)粒進(jìn)行序列測(cè)定。

2.3 不同分期的宮頸癌組織中Ki-67、p16及p53表達(dá)情況的比較 16例宮頸癌患者中，Ⅰ期10例，Ⅱ期6例。宮頸癌Ⅰ期與Ⅱ期患者Ki-67、p16及p53表達(dá)陽性率的比較，存在明顯差異(P<0.05)。見表3。

圖4 W esternBlot檢測(cè)VP3-myc融合蛋白表達(dá)

1.4 CIAV vp3 基因的PCR 擴(kuò)增 以提取的CIAV基因組DNA 為模板，利用上述引物擴(kuò)增CIAV vp3基因。反應(yīng)總體積為50 μL，其中上下游引物各0.5 μmol/L，dNTP 為0.2 mmol/L，模板100 ng，Taq plus 酶1 U，10×反應(yīng)緩沖液5 μL，加滅菌三蒸水補(bǔ)足至50 μL。反應(yīng)程序：95 ℃4 min，94 ℃45 s，57 ℃50 s，72 ℃1 min，循環(huán)30 次，72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后用DNA 回收試劑盒回收和純化。

2.4 VP3 蛋白對(duì)細(xì)胞活性的影響 為了確定VP3蛋白是否仍具有凋亡功能，將pEGFP-vp3 轉(zhuǎn)染至293T 細(xì)胞中，觀察其對(duì)293T 細(xì)胞活性的影響。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組和空載體轉(zhuǎn)染對(duì)照組(pEGFP-N1 組)比較，轉(zhuǎn)染后64 h、96 h、120 h 的細(xì)胞凋亡率分別為9.47%、13.17%和14.23%（見圖5）。與對(duì)照組相比，pEGFP-vp3 轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象明顯（P＜0.05）。

南京體育學(xué)院民間體育課程的教學(xué)目標(biāo)不是很明確，對(duì)于培養(yǎng)出什么樣的專業(yè)人才還是很模糊，在課程大綱的設(shè)定中沒有自己的特色，課時(shí)的分配還算合理，但不能滿足學(xué)生的需求。

圖5 VP3誘導(dǎo)細(xì)胞死亡作用

3 討論

CIAV VP3 蛋白，即“凋亡素”（Apoptin），被認(rèn)為是真正意義上可以選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、而不損傷正常細(xì)胞的蛋白之一，有可能發(fā)展成為一種很有前途的腫瘤基因治療藥物。這種獨(dú)特的選擇性凋亡效應(yīng)，與VP3 蛋白在細(xì)胞中的定位存在一定聯(lián)系。VP3 蛋白表達(dá)后迅速進(jìn)入腫瘤或轉(zhuǎn)化細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)，而一直只存在于正常細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)[8]。這種選擇性的細(xì)胞定位與VP3 蛋白C 端的兩個(gè)核定位信號(hào)（NLS1 和NLS2）密切相關(guān)，同時(shí)也與VP3 蛋白第108 位的蘇氨酸殘基（T108）的磷酸化相關(guān)[9]。即在腫瘤細(xì)胞中，VP3 蛋白的T108 處于磷酸化狀態(tài)；而在正常細(xì)胞中，VP3 蛋白的T108 氨基酸處于去磷酸化狀態(tài)。去掉VP3 蛋白中的核運(yùn)輸信號(hào)或者突變T108 氨基酸都會(huì)影響VP3 的凋亡作用，甚至使其喪失凋亡作用。本研究成功克隆到CIAV vp3 基因，并與GenBank 中 提 供Cux-1 株 的vp3 序 列 比 對(duì)，發(fā) 現(xiàn)VP3 在堿基水平只發(fā)生了一個(gè)堿基的突變，并沒有造成其氨基酸水平的突變，也就是說VP3 蛋白中對(duì)其凋亡作用起關(guān)鍵作用的區(qū)域和位點(diǎn)都未發(fā)生突變，說明VP3 蛋白仍可能具有其原有的凋亡功能。臺(tái)盼藍(lán)染色試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)VP3 蛋白仍具有一定的凋亡功能。

2) 跨站防誤閉鎖：實(shí)現(xiàn)變電站與變電站之間的閉鎖功能，杜絕多變電站同時(shí)操作時(shí)，線路帶電情況下合出線側(cè)接地刀閘的安全隱患。

VP3 蛋白誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的過程不需要p35 的介導(dǎo)，同時(shí)也不會(huì)因Bcl-2 的過量表達(dá)而受到抑制，因此可以誘導(dǎo)p35 缺失的腫瘤細(xì)胞凋亡，其應(yīng)用前景廣泛。目前，研究者發(fā)現(xiàn)VP3 選擇性地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡涉及到眾多蛋白，但其具體通路仍不清楚。本研究成功構(gòu)建表達(dá)雞傳染性貧血病毒vp3 基因的真核表達(dá)載體pEGFP-vp3，將該載體轉(zhuǎn)染至真核細(xì)胞中可以表達(dá)與綠色熒光蛋白（GFP）融合表達(dá)的VP3 蛋白，因此可以進(jìn)一步研究VP3 的細(xì)胞定位與VP3 的凋亡效應(yīng)之間的關(guān)系，并且也有利于研究VP3 與細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白之間的關(guān)系。為進(jìn)一步研究VP3 的功能奠定了良好的基礎(chǔ)。

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