姬長(zhǎng)云，程漢奎，張靜潔，鄧 超，鐘佳蓮，李維鋮，鄧銜柏

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州510642）

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）又稱作嘔吐毒素（vomitoxin，VT），屬于單端孢霉烯族化合物，是全世界飼料和糧食污染的主要真菌毒素之一[1-2]。隨著對(duì)嘔吐毒素的深入研究，發(fā)現(xiàn)DON 對(duì)動(dòng)物和人都會(huì)產(chǎn)生免疫抑制作用。它可劑量依賴地誘導(dǎo)并促進(jìn)小鼠胸腺細(xì)胞的凋亡和抑制其增殖，從而對(duì)小鼠的免疫功能產(chǎn)生一定的負(fù)面影響[3-4]。還可以影響小鼠腸黏膜的生理屏障功能，干擾機(jī)體蛋白質(zhì)的合成，造成免疫系統(tǒng)抑制等[5]。

在動(dòng)物免疫學(xué)研究中，經(jīng)常需要了解外周血中淋巴細(xì)胞的分類及含量情況。根據(jù)來源和功能的不同，淋巴細(xì)胞可分為T 淋巴細(xì)胞、B 淋巴細(xì)胞、NK 細(xì)胞等幾大類[6]，T 細(xì)胞又分為CD4+、CD8+細(xì)胞亞群。CD4+細(xì)胞協(xié)助B 淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體，CD8+和CD4+能通過清除體內(nèi)被病毒感染的細(xì)胞或分泌具有抗病毒特性的細(xì)胞因子產(chǎn)生保護(hù)性免疫[7]。且CD4+/CD8+的比值可反映動(dòng)物體疾病的發(fā)展歷程,所以準(zhǔn)確地測(cè)定外周血中CD4+、CD8+細(xì)胞數(shù)量就顯得尤其重要[8]。正常生理狀態(tài)下，機(jī)體氧自由基的生成（氧化系統(tǒng)）和清除（抗氧化系統(tǒng)）存在一種動(dòng)態(tài)平衡。病理因素和外源有毒有害物質(zhì)會(huì)打破這種平衡，使自由基積累，造成機(jī)體氧化功能損傷。超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）、谷胱甘肽還原酶（GR）是機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分，在清除體內(nèi)氧自由基，緩解氧化損傷方面發(fā)揮著重要作用。

本試驗(yàn)通過研究嘔吐毒素對(duì)仔豬外周血液中CD4+、CD8+淋巴細(xì)胞亞群及血清中CAT、GSH-Px、SOD、MDA 活性的影響，揭示了實(shí)際生產(chǎn)中斷奶仔豬在誤食霉變飼料后，機(jī)體的細(xì)胞免疫及抗氧化功能遭受損傷所經(jīng)歷的過程，便于豬只在中毒前期未表現(xiàn)中毒癥狀時(shí)就提早采取措施，防治疾病的發(fā)生，也為實(shí)驗(yàn)室診斷和建立豬場(chǎng)健康體檢系統(tǒng)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 DON污染飼糧的準(zhǔn)備 準(zhǔn)確稱取一定量的DON標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma 公司，批號(hào)：097K4010），溶解于適量生理鹽水中配成一定濃度的溶液。將基礎(chǔ)飼糧平鋪于地面上，厚度適中，然后將配制好的DON 溶液噴灑于基礎(chǔ)飼糧上，攪拌，混勻。處理過程中保持底物含水量均勻且在20%左右，溫度約28 ℃，處理7 d。將處理好的飼糧與未處理的基礎(chǔ)飼糧按1∶1混合均勻。本試驗(yàn)周期為38 d，先后共處理飼料5次，每次每組取樣2 份裝入潔凈的密閉塑料袋，標(biāo)記，-20 ℃保存，用于測(cè)定DON 含量（處理后的飼糧中DON 濃度為2 mg/kg）。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 10 頭25 日齡平均體重為（7.70±1.00）kg 的杜×大×長(zhǎng)三元雜交斷奶仔豬，打耳號(hào)，做好標(biāo)記，隨機(jī)分為兩組，分別進(jìn)行基礎(chǔ)飼糧飼喂（對(duì)照組）、基礎(chǔ)飼糧+DON 飼喂（試驗(yàn)組）。試驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，正式試驗(yàn)期為38 d。仔豬在同一豬舍內(nèi)飼養(yǎng)，自由采食和飲水，每天飼喂2 次（早上8:00 和下午17:00）、清圈2 次，觀察仔豬采食和健康狀況。分別在試驗(yàn)第0、8、16、24 天采血檢測(cè)CD4+、CD8+淋巴細(xì)胞水平，在0、16、24、36 天采血檢測(cè)血清CAT、GSH-Px、SOD、MDA 的活性。

1.3 淋巴細(xì)胞亞群的測(cè)定 （1）取2 mL 新鮮抗凝血，與中性PBS 1∶1 混勻后慢慢加人等體積本分離液之液面上；（2）以400 g（約1 500 r/min）離心（水平轉(zhuǎn)子）15 min。此時(shí)離心管中由上至下細(xì)胞分4 層。第1 層為血漿層，第2 層為環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層，第3 層為透明的分離液層，第四層為紅細(xì)胞層。收集第二層細(xì)胞放入含中性PBS 洗滌液1mL 的試管中，充分混勻后，以500 g 約（1 800 r/min）離心20 min，棄去上清留沉淀細(xì)胞重新懸起，重復(fù)洗滌2 次即得所需淋巴細(xì)胞，所有操作均按試劑盒說明書進(jìn)行。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)淋巴細(xì)胞（美國(guó)BD 公司，F(xiàn)ACS420 型）。

1.4 血清CAT、GSH-Px、SOD、MDA 活性的測(cè)定

分別在試驗(yàn)第0、16、24、36 天頸靜脈采血，靜置30 min，離心，保留血清用來檢測(cè)抗氧化指標(biāo)。所用試劑盒為南京建成生物工程研究所測(cè)指標(biāo)分別為谷胱甘肽-過氧化物酶（GSH-Px），過氧化氫酶（CAT），超氧化物歧化酶（SOD），丙二醛（MAD）的活性，所有指標(biāo)均按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析和Duncan 氏法進(jìn)行各組間多重比較，以P＜0.05 作為差異性顯著判斷標(biāo)準(zhǔn)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 CD4+、CD8+淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果 由表1和圖1 可知，與對(duì)照組相比DON 組CD4+、CD8+、CD4+/CD8+無(wú)明顯變化，差異性不顯著。且試驗(yàn)組和對(duì)照組數(shù)據(jù)變化趨勢(shì)基本一致。

表1 淋巴細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果

2.2 血清CAT、GSH-Px、SOD、MDA 由表2 可見，與對(duì)照組相比，在試驗(yàn)第24 天和36 天SOD 的活性顯著降低，差異極顯著（P＜0.01）；在試驗(yàn)第16 天MDA 的活性顯著降低，差異顯著（P＜0.05）；在試驗(yàn)第16 天CAT 活性顯著降低，差異顯著（P＜0.05），第24、36 天MDA 差異極顯著（P＜0.01）；在試驗(yàn)第24、36 天，GSH-Px 活性顯著降低。隨著時(shí)間的增加試驗(yàn)組和對(duì)照組的SOD 活性逐漸降低，MDA 活性逐漸升高；CAT 指標(biāo)變化為對(duì)照組先降低在第36 天升高，試驗(yàn)組為逐漸降低；GSH-Px 指標(biāo)變化為對(duì)照組和試驗(yàn)組都在第24 天升高然后又降低。

3 結(jié)論與討論

3.1 DON 對(duì)CD4+、CD8+淋巴細(xì)胞的影響 T 淋巴細(xì)胞是外周血液中的主要淋巴細(xì)胞（約占80%～90%），是機(jī)體發(fā)揮細(xì)胞免疫和免疫調(diào)節(jié)作用的主要成分，并能對(duì)B 淋巴細(xì)胞分泌免疫球蛋白的過程進(jìn)行調(diào)控。 T 細(xì)胞具有多種生物學(xué)功能，如直接殺傷靶細(xì)胞，輔助或抑制B 細(xì)胞產(chǎn)生抗體，對(duì)特異性抗原和促有絲分裂原的應(yīng)答反應(yīng)以及產(chǎn)生細(xì)胞因子等都能起到一定的作用[9-10]。成熟的T 淋巴細(xì)胞表面均可表達(dá)CD3+分子，而CD4+、CD8+分子不能同時(shí)表達(dá)于同一成熟的T 淋巴細(xì)胞表面，故可將成熟的T 淋巴細(xì)胞分為CD4+淋巴細(xì)胞和CD8+淋巴細(xì)胞兩個(gè)亞群。這兩種細(xì)胞對(duì)免疫反應(yīng)和維持免疫穩(wěn)定起重要作用，機(jī)體細(xì)胞免疫功能正常時(shí)，CD4+/CD8+處于恒定范圍，若其平衡失調(diào)，則會(huì)導(dǎo)致機(jī)體免疫功能紊亂，產(chǎn)生一系列免疫病理變化，影響機(jī)體的免疫保護(hù)機(jī)制，引起一系列免疫缺陷疾病或自身免疫病[11-12]，CD4+/CD8+比值降低是疾病程度變重的主要標(biāo)志之一[13]，也提示患者機(jī)體處于免疫抑制狀態(tài)[14]。實(shí)驗(yàn)室可通過檢測(cè)CD4+、CD8+淋巴細(xì)胞亞群的百分率和CD4+/CD8+比值作為評(píng)價(jià)機(jī)體免疫狀況高低的依據(jù)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，CD4+、CD8+淋巴細(xì)胞亞群的百分率以及CD4+/CD8+比值未出現(xiàn)明顯差異，但數(shù)值較正常的比值要低，說明試驗(yàn)組對(duì)斷奶仔豬的淋巴細(xì)胞平衡產(chǎn)生一定的影響但不明顯，可能是DON 含量劑量低，仔豬的免疫系統(tǒng)對(duì)DON 有一定的耐受性。試驗(yàn)揭示了低劑量DON 對(duì)仔豬外周血液中CD4+、CD8+、CD4+/CD8+的平衡影響非常小，在感染毒素時(shí)間不久的情況下對(duì)仔豬的外周免疫系統(tǒng)產(chǎn)生較小的毒害作用。

表2 酶活性檢測(cè)結(jié)果

圖1 淋巴細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果

3.2 DON 對(duì)血清中CAT、GSH-Px、SOD、MDA 的影響 CAT、GSH-Px、SOD、MDA 都是反應(yīng)機(jī)體抗氧化水平的重要指標(biāo)，正常生理狀態(tài)下，機(jī)體氧自由基的生成（氧化系統(tǒng)）和清除（抗氧化系統(tǒng)）存在一種動(dòng)態(tài)平衡。病理因素和外源有毒有害物質(zhì)會(huì)打破這種平衡，使自由基積累,造成機(jī)體氧化損傷。超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）、谷胱甘肽還原酶（GR）是機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分，在清除體內(nèi)氧自由基，緩解氧化損傷方面發(fā)揮著重要作用。飼糧中添加自然霉變玉米可以降低大鼠機(jī)體抗氧化能力并損傷大鼠肝功能，其效應(yīng)隨飼糧中霉變玉米比例的增加而增強(qiáng)[15]。本次試驗(yàn)結(jié)果為CDA、GSH-Px、SOD、MDA 均有明顯下降，可能由于長(zhǎng)期的暴露在DON下，機(jī)體處于失代償狀態(tài)，與付瑩等[16]研究的基本一致，縱使DON 含量較低，但影響代償時(shí)間較長(zhǎng)，也會(huì)對(duì)機(jī)體造成一定程度的損傷。且對(duì)各種指標(biāo)的變化規(guī)律產(chǎn)生了一定影響。

3.3 結(jié)論 本研究表明，低劑量（2 mg/kg）DON 污染的飼糧雖然未明顯影響斷奶仔豬CD4+、CD8+淋巴細(xì)胞亞群的平衡，但是對(duì)仔豬機(jī)體的抗氧化水平造成了一定程度的損害，說明DON 在影響機(jī)體健康時(shí)，先是從破壞機(jī)體抗氧化系統(tǒng)開始的。

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