姚曉紅，吳逸飛，楊家?guī)洠?永 ，王 新 ，湯江武*

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與微生物研究所，浙江杭州 3 10021;2.杭州科皇飼料有限公司，浙江杭州 3 1115)

由于耐藥性問題，抗生素在飼料中的應(yīng)用受到嚴(yán)格限制。而益生菌是一類通過調(diào)控動(dòng)物腸道微生物區(qū)系的平衡，從而有效促進(jìn)宿主動(dòng)物健康和生長的微生物活菌制劑，且對(duì)動(dòng)物和人無毒副作用。目前常用的益生菌主要有乳酸菌、芽孢桿菌等。乳酸菌作為益生菌株應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖已有多年歷史，但其抗逆性較差，不耐熱，在飼料加工過程中損失較大。因此，產(chǎn)乳酸的芽孢桿菌成為近年乳酸菌研究的熱點(diǎn)。早在1989年，美國FDA公布的41種可用于飼料的安全菌株及1992年再次批準(zhǔn)的42種安全蓖株中，包括5種芽孢桿菌，凝結(jié)芽孢桿菌(Bacallus coagulans)排在第1位。凝結(jié)芽孢桿菌除具有乳酸菌和雙歧桿菌等益生功效外，還兼具有耐高溫、耐酸和耐膽鹽等高抗逆性，故其作為一種新型益生菌而日益為人們所重視［1］，是近年研究較為熱門的益生菌種。

研究表明，凝結(jié)芽孢桿菌應(yīng)用于生長肥育豬飼料中，可顯著提高豬的平均日增重，降低飼料成本，還可使糞便臭味降低，改善豬舍的飼養(yǎng)環(huán)境［2］。國內(nèi)外研究證明，服用凝結(jié)芽孢桿菌活菌能降低腸道pH值，減少臭氣，同時(shí)能顯著增加腸道內(nèi)雙歧桿菌的數(shù)量［3-4］。在此背景下，本試驗(yàn)嘗試從斷奶仔豬腸道內(nèi)容物樣品、菜園土壤、泡菜等多種微生物來源中分離耐膽鹽和低pH的凝結(jié)芽孢桿菌菌株，并對(duì)其抑菌特性進(jìn)行研究，以期為后期的生產(chǎn)應(yīng)用提供借鑒。

1 材料和方法

1.1 分離及篩選菌種培養(yǎng)基

培養(yǎng)基配方參照文獻(xiàn) ［5］。

改良 MRS培養(yǎng)基。蛋白質(zhì)10.0 g，牛肉膏10.0 g，檸檬酸氫二鈉2.0 g、無水乙酸鈉5.0 g，酵母膏5.0 g，葡萄糖5.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，吐溫-80 1.0 mL，硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g，水1 000 mL，調(diào)pH值6.2～6.5，115℃滅菌20 min。

乳酸菌增殖培養(yǎng)基 (YPG培養(yǎng)基)。葡萄糖5.0 g，蛋白質(zhì)5.0 g，酵母提取物1.0 g，CaCl20.10 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，調(diào)pH 6.8～7.0，115℃滅菌20 min。

1.2 菌株篩選方法

1.2.1 平板初篩

將采集的土樣、畜禽腸道內(nèi)容物等樣品接入改良的MRS培養(yǎng)基中，37℃下靜置培養(yǎng)，再將富集好的樣品轉(zhuǎn)入乳酸菌增殖培養(yǎng)基平板中，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，待菌落長出，挑取具有溶鈣圈的單菌落，反復(fù)劃線分離至獲得純菌株。

1.2.2 菌株產(chǎn)酸能力測(cè)定方法

根據(jù)EDTA螯合Ca離子測(cè)定乳酸的方法和總酸度的測(cè)定方案原理基本相同的原理，考慮初篩的快速性要求。試驗(yàn)采用pH計(jì)直接測(cè)定培養(yǎng)48 h后培養(yǎng)基中pH值來表示菌株產(chǎn)酸能力的強(qiáng)弱。

1.2.3 膽鹽耐受和低pH耐受檢測(cè)

取10支裝有10 mL乳酸菌增殖培養(yǎng)基的液體試管，分別調(diào)整pH至3.0，另取10支裝有10 mL乳酸菌增殖培養(yǎng)基的液體試管，分別加入終濃度為0.03%的牛膽鹽，均接入1%的初篩菌種，于37℃下培養(yǎng)24 h，以不調(diào)整pH和不添加膽鹽的試管作對(duì)照，于D600下檢測(cè)吸光度。

1.3 抑菌效果試驗(yàn)

1.3.1 平板抑菌試驗(yàn)

采用瓊脂擴(kuò)散法對(duì)篩選獲得的凝結(jié)芽孢菌進(jìn)行致病菌的抑制試驗(yàn)［6］。將凝結(jié)芽胞桿菌活化2～3代，10 000 r·min-1離心收集上清，制備菌種上清液。

指示菌的準(zhǔn)備。將枯草芽孢桿菌、啤酒酵母、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌活化2～3代后，將菌液濃度用無菌水調(diào)整至107mL-1，取1 mL菌液加入培養(yǎng)皿中，用LB培養(yǎng)基或PDA培養(yǎng)基傾注平板，待完全凝固后，每平板上放入牛津杯若干，在每個(gè)牛津杯中加入200μL的上清液，以空白MRS培養(yǎng)基為陰性對(duì)照，檢測(cè)加入培養(yǎng)上清液對(duì)指示菌的抑菌作用。

1.3.2 液體共培養(yǎng)試驗(yàn)

將復(fù)篩獲得的凝結(jié)芽孢桿菌菌種與大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等致病菌在LB培養(yǎng)基中共培養(yǎng)24 h后涂布平板，檢測(cè)凝結(jié)芽孢桿菌與指示菌的活菌數(shù)，以此反映凝結(jié)芽孢桿菌的抑菌活性。

1.4 菌株鑒定

參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［7］及《微生物學(xué)試驗(yàn)教程》［8］進(jìn)行接觸酶檢測(cè)、厭氧生長檢測(cè)、50℃生長檢測(cè)和7%NaCl生長檢測(cè)，之后再進(jìn)行一系列的驗(yàn)證檢測(cè)，包括糖、醇發(fā)酵、運(yùn)動(dòng)性檢測(cè)、淀粉水解試驗(yàn)、卵黃反應(yīng)、酪素水解生長溫度檢測(cè)和耐熱性檢測(cè)。分子生物學(xué)鑒定包括染色體DNA的提取、菌株16S rDNA的擴(kuò)增克隆及序列測(cè)定及BLAST比對(duì)，均參照文獻(xiàn) ［9］。

2 結(jié)果與分析

2.1 凝結(jié)芽孢桿菌初篩

以平板透明圈直徑為指標(biāo)，對(duì)不同來源的乳酸菌進(jìn)行初篩 (表1)，選取溶鈣圈大的菌株進(jìn)入下一步試驗(yàn)。本次篩選總共得到相關(guān)菌種35株，根據(jù)凝結(jié)芽孢桿菌的形態(tài)特點(diǎn)，選定菌株JA等16株呈桿狀的乳酸菌進(jìn)入復(fù)篩。

表1 菌種的初步篩選結(jié)果

2.2 凝結(jié)芽孢桿菌的復(fù)篩

2.2.1 YPG液體培養(yǎng)基中pH值的測(cè)定

表2表明，菌株E5等9株桿狀乳酸菌的產(chǎn)酸能力較強(qiáng)，故選這9株菌進(jìn)行后續(xù)膽鹽耐受能力和低pH值耐受性的檢測(cè)。

2.2.2 膽鹽和低pH值的耐受性

多種試驗(yàn)結(jié)果證明，菌株在腸道中定植的前提是能夠耐受胃部pH 3.0左右的考驗(yàn)和小腸中膽汁鹽對(duì)細(xì)菌的殺滅作用。為考察經(jīng)過復(fù)篩9株菌的膽鹽和pH值的耐受性，試驗(yàn)采用液體試管培養(yǎng)基的方法，以培養(yǎng)24 h的菌體濃度為指標(biāo)，篩選耐受膽鹽和低pH值的菌株 (表3)。

表2 初篩菌株在液體培養(yǎng)基上產(chǎn)酸能力

表3 膽鹽耐受和低pH值試驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，BFS-2，B4，NJ受膽鹽的毒害作用較小，受pH值影響也較其他菌株低。綜合考慮，選取B4，BFS-2，NJ進(jìn)行抑菌效果試驗(yàn)。

2.3 凝結(jié)芽孢桿菌抑菌試驗(yàn)

2.3.1 平板抑菌試驗(yàn)

試驗(yàn)表明，所篩選的3株凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)大腸桿菌、啤酒酵母、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌等4株指示菌均有一定的抑制作用。

由表4可知，3種凝結(jié)芽孢桿菌的抑制效果均較差，但對(duì)大腸桿菌等腸道條件致病菌的抑制情況較好，其中綜合效果最好的菌株為BFS-2。

表4 抑菌試驗(yàn)結(jié)果

2.3.2 液體共培養(yǎng)抑菌試驗(yàn)

由表5可知，在0～12 h時(shí)，大腸桿菌和凝結(jié)芽孢桿菌都有生長，菌數(shù)上升，這是由于新投入的菌體還未完全啟動(dòng)生長過程，特別是生長相對(duì)較慢的凝結(jié)芽孢桿菌。因此，大腸桿菌在剛投加時(shí)，菌數(shù)上升明顯;但24 h之后，大腸桿菌的菌數(shù)下降明顯，而凝結(jié)芽孢桿菌的菌數(shù)繼續(xù)上升，并在36 h達(dá)到最高。其后，由于培養(yǎng)液pH值的降低，而表現(xiàn)為菌數(shù)的下降和菌體的自溶。

表5 液體抑菌試驗(yàn)結(jié)果 (共培養(yǎng))

2.4 菌種鑒定

2.4.1 形態(tài)學(xué)鑒定

菌株BFS-2接種在培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)24 h后，顯微鏡下觀察其特征。結(jié)果表明，菌株BFS-2的單菌落呈圓形，不透明，突起邊緣整齊;革蘭氏染色呈陽性，細(xì)胞呈桿狀且可形成端生橢圓形芽孢，芽孢囊不明顯膨大，且接觸酶陽性，初步可判斷該菌株屬于芽孢桿菌屬。

2.4.2 生理生化特征鑒定

表6可知，菌株BFS-2革蘭氏染色陽性，可運(yùn)動(dòng)，接觸酶反應(yīng)陽性，可在高溫下生長，且可發(fā)酵多種糖類產(chǎn)酸，因而確定屬于芽孢桿菌屬細(xì)菌。

表6 菌株生理生化鑒定結(jié)果

2.4.3 分子鑒定

測(cè)得BFS-2菌株16SrDNA部分序列1 464 bp，該序列BLASTn比對(duì)結(jié)果與芽孢桿菌屬的16S rDNA序列高度相似，相似度達(dá)99%。結(jié)合生理生化結(jié)果，并參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行分析后，確定菌株BFS-2為凝結(jié)芽孢桿菌。

3 小結(jié)與討論

從斷奶仔豬腸道、菜園土壤、泡菜等不同來源樣品中分離乳酸菌，通過一系列的功能性評(píng)價(jià)試驗(yàn)，篩選出1株對(duì)低pH和膽鹽耐受性強(qiáng)，并對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌具有較好的抑菌效果的菌株BFS-2。經(jīng)鑒定該菌株為凝結(jié)芽孢桿菌。研究表明，微生態(tài)制劑不但能提高機(jī)體的生長性能［10］，而且還能降低腸桿菌科細(xì)菌在胃腸道各部位定植水平，從而影響腸道菌群的微生態(tài)平衡［11］。

凝結(jié)芽孢桿菌的益生作用在國外早已證明。Adami等［12-13］給仔豬飼喂凝結(jié)芽孢桿菌后，可顯著降低仔豬死亡率，提高飼料轉(zhuǎn)化率，仔豬糞便中腸球菌和大腸桿菌數(shù)量明顯降低。我國關(guān)于乳酸芽孢桿菌微生態(tài)制劑的相關(guān)報(bào)道較少。

本試驗(yàn)采用營養(yǎng)培養(yǎng)基從斷奶仔豬腸道、菜園土壤、泡菜等不同來源樣品中分離獲得乳酸菌35株，根據(jù)凝結(jié)芽孢桿菌的形態(tài)特征，及其產(chǎn)酸能力的大小，將產(chǎn)酸能力強(qiáng)的9株菌進(jìn)行膽鹽耐受性和低pH耐受性試驗(yàn)，獲得3株耐受性強(qiáng)的菌株，其中菌株BFS-2對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌具有較好的抑菌效果。經(jīng)生理生化及分子測(cè)序分析，鑒定菌株BFS-2為凝結(jié)芽孢桿菌。凝結(jié)芽孢桿菌是近年來益生菌領(lǐng)域的后起之秀，其除具有乳酸菌和雙歧桿菌等保健功效外，還具有耐高溫、耐酸和耐膽鹽等高抗逆性［14］，其作為一種新型益生菌正日益被人們所重視。本文篩選獲得1株耐低pH和膽鹽，并具有較好的抑菌效果的凝結(jié)芽孢桿菌BFS-2，在飼料工業(yè)和養(yǎng)殖中具有潛在的應(yīng)用和開發(fā)前景。

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