龍金烈，黃長(zhǎng)江

(溫州醫(yī)科大學(xué)環(huán)境安全與健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估研究院，浙江溫州 3 25035)

四溴雙酚A(TBBPA)是目前全球生產(chǎn)量和使用量最大的溴代阻燃劑之一［1］，被廣泛用于電器、各種電子設(shè)備、紡織品、家具等日常商品中，無(wú)論是反應(yīng)型還是添加型產(chǎn)品都會(huì)將TBBPA及其代謝物釋放到環(huán)境 (土壤、沉積物、水體和大氣)中去，并在相應(yīng)的介質(zhì)中檢測(cè)出［2］。TBBPA性質(zhì)會(huì)隨著外界環(huán)境的改變而產(chǎn)生變化，如當(dāng)pH值升高時(shí)，可增加TBBPA的溶解性和遷移能力［3］。據(jù)日本相關(guān)報(bào)道，TBBPA在土壤和沉積物中的濃度范圍分別為0.5～140μg·kg-1(干重)和2～150μg·kg-1(干重)［4-5］，在電器回收廠的室內(nèi)氣體可檢測(cè)出TBBPA［6］，生產(chǎn)地附近空氣可檢測(cè)出TBBPA，其中的濃度約1.8 μg·m-3［7］，根據(jù)資料表明，我國(guó)青島和珠江三角洲近岸海域底泥中均檢測(cè)到TBBPA［8］，在我國(guó)廣東貴嶼某電子垃圾拆解點(diǎn)附近大氣中TBBPA的濃度范圍為66.01～95.04 ng·m-3，上海和臺(tái)州典型電子廢棄物拆解場(chǎng)地、廢棄電視機(jī)拆解廠中，TBBPA在人工拆解的廢棄物中的含量為557 ng·g-1，灰塵中TBBPA的含量與材料中的濃度分布密切相關(guān)［9］。有關(guān)TBBPA毒性作用研究報(bào)道不少，如:肺組織免疫作用的改變［10］、內(nèi)分泌干擾效應(yīng)［11-12］、生殖［13］及肝腎毒性［14］等等，但關(guān)于TBBPA的氣相暴露對(duì)肺毒性的研究，至今國(guó)內(nèi)外尚未見相關(guān)報(bào)道。目前認(rèn)為空氣顆粒物(particulate matter，PM)污染與呼吸系統(tǒng)疾病如哮喘、肺癌等密切相關(guān)，粒徑＜2.5μm的PM進(jìn)入肺后可與肺泡巨噬細(xì)胞、肺上皮細(xì)胞作用，刺激釋放各種細(xì)胞因子，導(dǎo)致肺炎癥和肺纖維化［15］。本研究通過模擬浙江臺(tái)州地區(qū)電子垃圾拆卸地附近的空氣PM中TBBPA的含量并以小鼠作為模型進(jìn)行肺毒性相關(guān)研究，為評(píng)估電子廢棄物拆解回收的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)及采取相應(yīng)改善措施提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

氣相暴毒柜 (天津合普公司)，臺(tái)式低溫高速離心機(jī)、微量移液器及QPCR儀器 (5417R，德國(guó)Eppendorf公司)，超純水器 (UPWS-1-20T，杭州永潔達(dá)凈化科技有限公司)，精密電子天平(Satorius BS124S，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)，顯微鏡 (Olympus CX31RTSF，Japan)，24孔無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)板及1.5 mL離心管 (碧云天生物技術(shù)研究所)，-80℃超低溫冰箱 (美國(guó) Thermo Forma公司)。

供試試劑有DMSO(廣東省化學(xué)試劑工程技術(shù)研究開發(fā)中心)，TBBPA(Sigma-Aldrich，USA)，MDA、BCA總蛋白測(cè)定試劑盒、T-AOC、LDH(乳酸脫氫酶)、PBS緩沖液、灌胃針 (碧云天生物技術(shù)研究所)，瑞氏染液 (珠海貝索生物技術(shù)有限公司)、QPCR試劑 (大連寶生物工程有限公司)。

供試動(dòng)物為8周齡雄性ICR小鼠 (購(gòu)于溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠染毒方法

將8周齡ICR雄性小鼠隨機(jī)分為4組(DMSO，DMSO+0.1μg·m-3TBBPA，DMSO+1 μg·m-3TBBPA，DMSO+10 μg·m-3TBBPA)，放入染毒柜子中連續(xù)染毒2個(gè)月，每天染毒8 h，上午4 h，下午4 h，中午取出喂食2 h。

1.2.2 肺灌洗液的取樣、細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類

用灌胃針吸取無(wú)鈣、鎂離子中性PBS灌洗肺組織5次，每次量均為1 mL，每次吸取的灌洗液分別放在按號(hào)碼標(biāo)記的EP管中，抽取的灌洗液均放置于冰上，第1管上清吸取后保存于-80℃，用于炎癥因子、蛋白等的測(cè)定。其余4管上清棄掉，保存下來的細(xì)胞與第1管的細(xì)胞沉淀混合在一起4℃ 300 r·min-1離心4 min，棄掉上清后，向沉淀里加入100μL的無(wú)鈣、鎂離子中性PBS中混勻，用于細(xì)胞的總數(shù)的計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)完之后再4℃300 r·min-1離心4 min，棄掉上清，向沉淀里加入20μL的無(wú)鈣、鎂離子中性PBS重懸混勻，接著涂片、晾干、用瑞氏染色液 A液染30 s，B液染1 min，油鏡下每個(gè)標(biāo)本計(jì)數(shù)200個(gè)白細(xì)胞并進(jìn)行分類計(jì)數(shù)。

1.2.3 引物的設(shè)計(jì)

引物的設(shè)計(jì)用primer premier 5.0軟件與NCBI在線驗(yàn)證相結(jié)合，具體引物見表1。

表1 基因上下游的引物

2 結(jié)果與分析

2.1 氣相TBBPA對(duì)小鼠肺灌洗液的影響

圖1所示，與對(duì)照組相比，TBBPA處理組灌洗液中白細(xì)胞總數(shù)、巨噬細(xì)胞數(shù)及多形核白細(xì)胞數(shù)(polymorphonucleocytes，PMNs)均升高，1μg·m-3組的細(xì)胞總數(shù)升高顯著 (P ＜0.05)，1μg·m-3組 (P ＜ 0.01)及10μg·m-3組 (P ＜0.05)的PMNs升高明顯，對(duì)巨噬細(xì)胞數(shù)的影響未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖1 小鼠肺灌洗液中的相關(guān)指標(biāo)

TBBPA處理組灌洗液中總蛋白含量、ALP及LDH活性較對(duì)照組均升高，10μg·m-3組總蛋白含量升高較為明顯 (P ＜0.05)，1μg·m-3組ALP活性升高明顯 (P＜0.05)。

2.2 氣相TBBPA對(duì)小鼠肺組織的影響

如圖2所示，處理組雙肺臟器系數(shù)均不同升高，但未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;TBBPA處理組肺總SOD活性升高，1μg·m-3組升高趨勢(shì)相對(duì)較大，但均未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;1μg·m-3及10μg·m-3處理組肺MDA含量升高，而0.1μg·m-3組降低，均未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;TBBPA處理組肺 TAOC降低，1μg·m-3組降低趨勢(shì)相對(duì)較大，但均未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖2 小鼠肺組織的相關(guān)指標(biāo)

2.3 氣相TBBPA對(duì)小鼠肺組織相關(guān)基因的影響

如圖3所示，與對(duì)照組相比，TBBPA處理組肺組織SP-A、SP-B、SP-D、CCSP、Cyp1A1基因表達(dá)均有上調(diào)趨勢(shì)，其中，1μg·m-3(P ＜0.01)及10μg·m-3組 (P ＜0.05)的 SP-B上調(diào)顯著，1μg·m-3(P ＜0.05)的SP-D上調(diào)顯著，10μg·m-3組的CCSP上調(diào)顯著 (P ＜0.05)。

3 小結(jié)與討論

TBBPA氣相暴露可引起肺組織氧化應(yīng)激作用及炎癥反應(yīng)。研究表明，許多污染物發(fā)揮毒作用的重要環(huán)節(jié)之一是氧化應(yīng)激［16］，李亞寧等［17］研究表明TBBPA對(duì)顫蚓具有氧化脅迫作用，包括引起SOD、CAT、GST活性的變化，本研究顯示，處理組中肺組織總SOD有升高趨勢(shì)，TAOC有降低趨勢(shì)，MDA有升高趨勢(shì)，可能是由于TBBPA的氣相暴露引起了氧化脅迫作用并伴隨有脂質(zhì)過氧化物的堆積。另外，處理組肺灌洗液中總細(xì)胞數(shù)、巨噬細(xì)胞數(shù)及PMNs數(shù)增加，說明TBBPA的氣相暴露引起了小鼠的氣道炎癥反應(yīng)。TBBPA的毒性與文獻(xiàn)的報(bào)道一致，但是，本研究做的是氣相TBBPA毒性機(jī)制研究，在我國(guó)空氣污染嚴(yán)峻的今天，氣相TBBPA的毒性機(jī)制研究似乎更有實(shí)際意義。

圖3 小鼠肺組織相關(guān)基因表達(dá)情況

TBBPA氣相暴露可引起肺組織細(xì)胞膜損傷。TBBPA暴露后測(cè)定小鼠肺灌洗液中總蛋白及ALP發(fā)現(xiàn)這些值均升高，說明氣相TBBPA暴露后引起了肺組織細(xì)胞膜的損傷，從而使總蛋白及ALP從細(xì)胞內(nèi)漏出至胞外。

TBBPA氣相暴露影響肺上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和代謝并激發(fā)自身的免疫保護(hù)作用。通常認(rèn)為肺泡上皮由Ⅰ和Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞構(gòu)成，在肺損傷修復(fù)過程中，Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞可以轉(zhuǎn)變?yōu)棰裥头闻萆掀ぜ?xì)胞［18］，肺表面活性物質(zhì) (PS)是由Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞分泌的二棕櫚酰卵磷脂等磷脂成分構(gòu)成，有維持肺泡形態(tài)的功能 (降低肺泡表面氣-液表面張力、防止吸氣時(shí)肺泡過度膨脹、呼氣時(shí)肺泡過度塌陷等)。10%的PS由4種表面活性蛋白構(gòu)成，即SP-A、SP-B、SP-C、SP-D。SP-A及SP-D是親水性蛋白，與PS的代謝及結(jié)構(gòu)有關(guān)，主要功能為參與肺部固有免疫，SP-B及SP-C為疏水性蛋白，能降低肺泡氣液界面的表面張力［19］。本研究通過QPCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):與對(duì)照組相比，處理組肺組織SP-B及SP-D基因上調(diào)，說明TBBPA氣相暴露肺泡上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和代謝的改變，并激發(fā)了自身的免疫功能，達(dá)到機(jī)體自身保護(hù)的目的。

TBBPA氣相暴露可激發(fā)自身抗炎及抗纖維化作用。Lesur等研究發(fā)現(xiàn)特發(fā)性肺纖維化患者肺泡液中的CCSP較對(duì)照組的低［20］，大鼠肺間質(zhì)纖維化CCSP陽(yáng)性細(xì)胞較對(duì)照組明顯減少［21］，上述研究結(jié)果均表明CCSP具有抗纖維化作用。本研究通過QPCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):與對(duì)照組相比，處理組肺組織CCSP較對(duì)照組上調(diào)。說明TBBPA氣相暴露激發(fā)自身了機(jī)體抗炎及抗纖維化作用。

TBBPA氣相暴露可激發(fā)肺組織自身代謝功能。通常認(rèn)為，細(xì)胞色素P450是重要的參與藥物水解、還原、氧化的I相反應(yīng)代謝酶，使所催化的藥物極性增大，利于與Ⅱ相反應(yīng)中與內(nèi)源性小分子(如乙?；⒐入赘孰?、葡萄糖醛酸)結(jié)合，從膽汁和腎臟排出。目前，發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物存在14個(gè)P450基因家族，26個(gè)基因亞家族，CYP1家族基因定位于第15號(hào)染色體上，包括 Cyp1A1和Cyp1A2。本研究通過QPCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):與對(duì)照組相比，處理組肺組織Cyp1A1較對(duì)照有上調(diào)趨勢(shì)。有可能肺組織中的Cyp1A1基因參與了由于氣相暴毒而進(jìn)入肺內(nèi)的TBBPA的代謝作用，利于后者的排出。

［1］ Bromine Science and Environmental Forum，(BSEF)2009［EB/OL］.http://www.bsef.com.

［2］ 李亞寧，周啟星.四溴雙酚-A的代謝轉(zhuǎn)化與生態(tài)毒理效應(yīng)研究進(jìn)展［J］.生態(tài)學(xué)雜志，2008(2):263-268.

［3］ 彭浩.環(huán)境及生物樣品中溴代阻燃劑四溴雙酚-A(TBBPA)水平的研究［D］.北京:中央民族大學(xué)，2007.

［4］ Watanable I，Kashimoto T，Tatsukawa R.The flame retardant terabromobisphenol-A and it metabolite found in river and marine sediments in Janpan ［J］.Chemosphere，1983，12:1533-1839.

［5］ Watanabe I，Kashimoto T，Tatsukawa R.Identification of the flame retardant tetrabromobisphenol-A in the river sediment and the mussel collected in Osaka ［J］.Bulletin of environmental contamination and toxicology，1983，31(1):48-52.

［6］ Sj-din A，Carlsson H，Thuresson K A J，et al.Flame retardants in indoor air at an electronics recycling plant and at other work environments［J］.Environmental science＆ technology，2001，35(3):448-454.

［7］ Zweidinger R A，Cooper S D，Erickson M D，et al.Sampling and analysis for semivolatile brominated organics in ambient air［C］ //Monitoring Toxic Substances(Schuetzle D，ed).ACS Symposium Series.1979，94:217-231.

［8］ 楊永亮，潘靜，李悅，等.青島近岸沉積物中持久性有機(jī)污染物多氯萘和多溴聯(lián)苯醚 ［J］.科學(xué)通報(bào)，2004，48(21):2244-2251.

［9］ 鄧晶晶.電子廢棄物拆解對(duì)灰塵中溴代阻燃劑與重金屬含量及分布的影響研究［D］.上海:華東理工大學(xué)，2014.

［10］ Watanabe W，Shimizu T，Sawamura R，et al.Effects of tetrabromobisphenol A，a brominated flame retardant，on the immune response to respiratory syncytial virus infection in mice［J］.International immunopharmacology，2010，10(4):393-397.

［11］ Kitamura S， Kato T， Iida M， et al. Anti-thyroid hormonalactivity of tetrabromobisphenol A，a flame retardant，and related compounds:Affinity to the mammalian thyroid hormone receptor and effect on tadpole metamorphosis［J］.Life Sciences，2005，76(14):1589-1601.

［12］ Kitamura S，Jinno N，Ohta S，et al.Thyroid hormonal activity of the flame retardants tetrabromobisphenol A and tetrachlorobisphenol A ［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，2002，293(1):554-559.

［13］ Kuiper R V， Van Den Brandhof E J. Toxicity of tetrabromobisphenol A(TBBPA)in zebrafish(Danio rerio)in a partial life-cycle test［J］.Archives of Toxicology，2007，81(1):1-9.

［14］ Tada Y，F(xiàn)ujitani T ，Ogata A，et al.Flame retardant tetrabromobisphenol A induced hepatic changes in ICR male mice［J］.Environmental Toxicology and Pharmacology，2007 ，23(2):174-178.

［15］ Roger OM.Use of mechanist ic data in assessing human risks from exposure to parti cles ［J］.Environmental Health Perspectives，1997 ，105(suppl5):1363-1372.

［16］ Franco R， Sanchez-OIea R， Reyes-Reyes E M，et al.Environmental toxicity，oxidative stress and apoptosis:Menage a Trois［J］. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis，2009，674:3-22.

［17］ 李亞寧，周啟星，胡獻(xiàn)剛，等.四溴雙酚-A污染對(duì)顫蚓的氧化脅迫及毒性［J］.環(huán)境科學(xué)，2008，29(7):2012-2017.

［18］ Castranova V，Rabovsky J，Tucker JH，et al.The alveolar type II epithelial cell:a multifunctional pneumocyte ［J］.T oxicology and applied pharmacology，1988，93(3):472-483.

［19］ Voss T，Melchers K.，Scheirle G，et al，Structural comparison of recom-binant pulmonary surfactant protein SP-A derived from two human coding sequences:implications for the chain composition of natural human SP-A ［J］.American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology，1991.4:88-94.

［20］ Lesur O，Bernard A，Arsalane K，et al.Clara cell protein(CC16)induces a phospholipase A2-mediated inhibition of fibroblast migrat ion in vitro ［J］.American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine，1995，152(1):290-297.

［21］ Daly HE，Baecher-Allan CM，Barth RK，et al.Bleomycin induces strain-dependent alterations in the pattern of epithelial cell specific marker expression in mouse lung［J］.Toxicology and Applied Pharmacology，1997，142(2):303-310.