周媛媛，曾凡軍，熊曉琦，阮玉姝，萬曉蓉，宋新宇

(三峽大學第一臨床醫(yī)學院宜昌市中心人民醫(yī)院，湖北宜昌443000)

肺性腦病是慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者嚴重的并發(fā)癥，病死率高達60%左右［1］。其發(fā)病機制尚未完全闡明，神經(jīng)元自噬可能是其發(fā)病機制之一，β-葡糖腦苷酶(β-GBA)、Atg7、p62為神經(jīng)元自噬相關(guān)標志物［2］。2012年1月～2014年1月，我們觀察了肺性腦病患者腦脊液β-GBA、Atg7、p62水平變化，并探討其臨床意義。現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 宜昌市中心人民醫(yī)院收治的COPD合并肺性腦病者50例(觀察組)及單純COPD患者50例(對照組)，均符合中華醫(yī)學會呼吸病學會COPD診斷標準［3］;排除合并結(jié)核性胸膜炎、病毒或寄生蟲感染者，既往有中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害及惡性腫瘤患者。觀察組男33例、女17例，年齡(66.8± 6.3)歲;合并消化道出血2例、代謝紊亂8例。對照組男29例、女21例，年齡(67.2±7.1)歲;合并消化道出血1例、代謝紊亂2例。兩組基本資料具有可比性，患者或家屬簽署知情同意書，并經(jīng)宜昌市中心人民醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 檢測方法 患者均行腰椎穿刺采集腦脊液，離心后采用ELISA法檢測β-GBA、Atg7蛋白，試劑盒購自美國SIGMA公司，按說明操作。Western blot法檢測p62蛋白:運用全蛋白提取試劑盒提取兩組細胞蛋白，－80℃凍存?zhèn)溆谩?0%的SDS-PAGE膠分離相應蛋白，采用濕法轉(zhuǎn)膜45 min，5%脫脂奶粉封閉1 h后加入1∶1 000稀釋的兔抗人p62一抗，4℃孵育過夜，次日PBS洗膜后加入稀釋比例為1∶5 000的山羊抗兔二抗，室溫孵育1 h，PBS洗膜后行ECL發(fā)光。選用β-actin蛋白為內(nèi)參蛋白對照，以蛋白灰度值表示其表達量。

1.2.2 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。計量資料用s表示，兩組比較用t檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

兩組腦脊液β-GBA、Atg7、p62水平比較，見表1。

表1 兩組腦脊液β-GBA、Atg7、p62水平比較(s)

表1 兩組腦脊液β-GBA、Atg7、p62水平比較(s)

注:與對照組比較，*P＜0.05。

組別 n β-GBA(pg/mL) Atg7(pg/mL)p62觀察組 50 34.6±6.8* 12.4±3.2*0.35±0.05對照組50 15.5±3.6 2.8±0.6 0.23±0.03

3 討論

COPD患者合并感染時常會出現(xiàn)低氧及CO2潴留，極易并發(fā)肺性腦病，患者常表現(xiàn)為淡漠、反應遲鈍、嗜睡、譫妄或昏迷等意識障礙。

肺性腦病發(fā)生、發(fā)展過程中，缺氧是核心因素。神經(jīng)元缺氧可致自噬死亡或凋亡。長期以來，自噬被認為是神經(jīng)元的一種保護性作用，在維持缺血、缺氧等應激狀態(tài)下細胞存活、清除細胞內(nèi)衰老細胞器及錯誤折疊蛋白中起重要作用。近年發(fā)現(xiàn)，在某些條件下細胞自噬也能導致細胞死亡。自噬作為一種重要的物質(zhì)代謝方式，它的發(fā)生受到嚴格的調(diào)節(jié)和控制。自噬的調(diào)控通路可分為mTOR調(diào)節(jié)途徑和mTOR途徑不依賴性調(diào)節(jié)途徑［4］。在缺血缺氧情況下，自噬的發(fā)生主要由mTOR途徑調(diào)控。p62與自噬密切相關(guān)，p62偶聯(lián)于微管相關(guān)蛋白輕鏈3，參與自噬體的構(gòu)成，是一種調(diào)節(jié)因子，在自噬中、晚期會降解［5］。通常情況下，細胞內(nèi)p62表達水平與自噬活性存在負相關(guān)。例如，在饑餓誘導的細胞自噬缺陷狀態(tài)下，Mizushima等［6］觀察到p62的蓄積。研究證實，細胞內(nèi)p62的表達水平與多種自噬相關(guān)因子關(guān)系密切［7］，但細胞自噬不是p62惟一的降解途徑［8］。本研究發(fā)現(xiàn)，COPD合并肺性腦病患者，腦脊液中p62蛋白水平顯著增高，表明肺性腦病患者中樞神經(jīng)元自噬增強。自噬增強有助于提高在缺氧及CO2潴留的病理狀態(tài)下，提高神經(jīng)元對缺氧及高CO2致?lián)p傷的耐受力，起到一定的保護性效應。

β-GBA是一種水解酶，存在于溶酶體內(nèi)。最初發(fā)現(xiàn)與戈謝病相關(guān)，基因突變導致β-GBA減少或缺乏，致使巨噬細胞內(nèi)的葡萄糖腦苷脂不能被水解，蓄積在溶酶體中，導致細胞功能受到影響。隨后發(fā)現(xiàn)，β-GBA與帕金森病相關(guān)［9］。本研究發(fā)現(xiàn)，β-GBA與肺性腦病相關(guān)，肺性腦病患者，腦脊液中β-GBA水平升高。由于自噬與溶酶體相關(guān)，肺性腦病誘發(fā)的自噬效應，是否與β-GBA有直接或間接關(guān)系，尚需進一步研究。

目前，研究發(fā)現(xiàn)自噬體的形成至少需要16種Atg基因的參與。Atg1是第一個被成功克隆的自噬基因［10］，Atg1缺乏時自噬發(fā)生受到抑制［11］。Atg7是一種泛素E1樣連接酶，可以激活泛素樣蛋白Atg12和Atg8。Atg7可以激活哺乳動物中的所有3種Atg8，即GATE-16、GABARAP和LC3。自噬體的形成需要一個泛素樣連接體系，其中Atg12和Atg5共價結(jié)合，并定位到自噬體囊泡中。Atg7是泛素樣蛋白通路中位置上游的關(guān)鍵基因，為自噬泡形成的必需蛋白質(zhì)分子［12］。有研究證實，在阻斷小鼠L929細胞中Atg7的表達后，可以顯著降低自噬性細胞死亡的發(fā)生率［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，肺性腦病患者腦脊液Atg7水平顯著升高，可能是神經(jīng)元損傷后部分神經(jīng)元裂解后蛋白釋放到蛛網(wǎng)膜中。

綜上所述，COPD肺性腦病患者腦脊液β-GBA、Atg7、p62蛋白水平升高，而Atg7及其參與的泛素樣蛋白通路可能是肺性腦病患者神經(jīng)元自噬發(fā)生的一條重要通路。通過這一研究，我們可更進一步了解肺性腦病神經(jīng)元自噬發(fā)生的分子機制，從而為肺性腦病的診治尋找到新靶點。

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