艾俊(曲靖市第一人民醫(yī)院腫瘤外科,云南曲靖 655000)

小白菊內(nèi)酯對人前列腺癌細(xì)胞PC-3凋亡作用的機(jī)制探討

艾俊
(曲靖市第一人民醫(yī)院腫瘤外科,云南曲靖 655000)

摘要目的:探討小白菊內(nèi)酯誘導(dǎo)人前列腺癌細(xì)胞PC-3凋亡的作用及其機(jī)制。方法:體外培養(yǎng)人前列腺癌細(xì)胞PC-3,用不同濃度(0、10、20、40μmol·L-1)小白菊內(nèi)酯作用PC-3細(xì)胞24、48、72 h后,采用CCK8法觀察PC-3細(xì)胞在增殖方面的變化,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測小白菊內(nèi)酯對PC-3細(xì)胞凋亡的影響,采用RT-PCR技術(shù)檢測PC-3細(xì)胞bax、bcl-2的m RNA表達(dá)水平。結(jié)果:經(jīng)小白菊內(nèi)酯處理后,CCK8檢測顯示PC-3細(xì)胞增殖率顯著下降(P<0.05),流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示PC-3細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05),RT-PCR檢測顯示PC-3細(xì)胞bax m RNA表達(dá)水平增高(P<0.05)、bcl-2 m RNA表達(dá)水平降低(P<0.05)。結(jié)論:小白菊內(nèi)酯通過誘導(dǎo)凋亡能抑制人前列腺癌細(xì)胞PC-3的增殖,這可能與其上調(diào)bax和降低bcl-2 m RNA表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞:小白菊內(nèi)酯;PC-3細(xì)胞;凋亡;Bcl-2 mRNA;Bax m RNA

前列腺癌為侵襲性腺癌,生物學(xué)特點(diǎn)為前列腺功能障礙和隨著時間發(fā)展而進(jìn)行的繼發(fā)性轉(zhuǎn)移[1,2]。在全球范圍內(nèi),前列腺癌是男性癌癥死亡相關(guān)的第六大病因,其發(fā)病率在美國已經(jīng)攀至第二名[3,4]。近年來,我國前列腺癌的發(fā)病率和病死率也在呈上升趨勢[5]。該病早期可采用手術(shù)治療,晚期通常采用包括外科手術(shù)、放射療法、激素療法和化學(xué)療法,或幾種方法的組合治療。但是這些傳統(tǒng)方法有著很大弊端,激素阻斷治療隨著治療時間的延長,腫瘤往往會轉(zhuǎn)變?yōu)榧に氐挚剐颓傲邢侔?而大多數(shù)現(xiàn)有的化療則會出現(xiàn)顯著的副作用,如尿失禁和勃起功能障礙等[6,7]。因此,發(fā)展新的治療策略,從分子靶點(diǎn)上尋找一種高效低毒的抗前列腺癌藥物對提高晚期前列腺癌患者的生存率和改善患者癥狀具有重大意義。

小白菊內(nèi)酯是從菊科植物中提取的一種倍半萜內(nèi)酯化合物,主要用于治療偏頭痛、風(fēng)濕病及炎癥[8]。近年來研究發(fā)現(xiàn),小白菊內(nèi)酯具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性,在體外可抑制多種腫瘤細(xì)胞株的生長增殖,比如肝癌[9]、卵巢癌[10]、乳腺癌[11]和膽管癌[12]等。但小白菊內(nèi)酯對人前列腺癌細(xì)胞PC-3的作用還未見報道,因此,本研究擬通過體外實(shí)驗(yàn),觀察不同濃度小白菊內(nèi)酯作用于人前列腺癌PC-3細(xì)胞株后細(xì)胞增殖、凋亡的情況,并觀察PC-3細(xì)胞bax、bcl-2 mRNA表達(dá)水平的變化,初步探討其可能的作用機(jī)制,為小白菊內(nèi)酯臨床治療前列腺癌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

PC-3細(xì)胞株(中科院上海細(xì)胞生物研究所),小白菊內(nèi)酯(美國Sigma公司),RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Gibco公司),酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)。流式細(xì)胞儀(美國Couler公司),CCK8試劑盒、V-FITC凋亡檢測試劑盒(上海碧云天研究所)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

PC-3細(xì)胞接種于含10%胎牛血清(FBS)和100 U·ml-1青霉素、100 U·ml-1鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中,置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 藥物配制

小白菊內(nèi)酯用DMSO溶解配制成濃度為100 mmol·L-1的藥液,置于4℃冰箱避光保存,用時以含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋后使用。

1.2.3 PC-3細(xì)胞增殖活性測定

采用CCK8法測定PC-3細(xì)胞增殖抑制情況。收集對數(shù)生長期PC-3細(xì)胞,消化、計數(shù),按每孔5×103個細(xì)胞接種于96孔板中,每孔加入細(xì)胞懸液100μl,置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)預(yù)培養(yǎng)24 h。之后向?qū)嶒?yàn)組每孔加入10μl含不同濃度小白菊內(nèi)酯的RPMI-1640培養(yǎng)基使得實(shí)驗(yàn)組的終濃度分別為10、20、40μmol·L-1,另設(shè)對照組(不含小白菊內(nèi)酯),每組設(shè)4個副孔以確保實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性。分別使藥物作用24、48、72 h后,在避光條件下每孔加入10μl CCK8溶液。放回培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育2 h 后,取出培養(yǎng)板用酶標(biāo)儀測每組的吸光值(A4 5 0),實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.4 PC-3細(xì)胞凋亡率測定

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測PC-3細(xì)胞凋亡率。消化、收集PC-3細(xì)胞,按每孔1×106個細(xì)胞的密度接種于6孔板。待細(xì)胞完全貼壁后換液,加入含不同濃度小白菊內(nèi)酯(10、20、40μmol·L-1)的完全培養(yǎng)基,另設(shè)對照組(加入等體積完全培養(yǎng)基),每組設(shè)5個副孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集各組細(xì)胞,以4℃的PBS溶液洗滌3次,用Annexin V-FITC及碘化丙啶(PI) (50μg·ml-1)避光室溫染色15 min后,流式細(xì)胞儀檢測PC-3細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 PC-3細(xì)胞bax、bcl-2 m RNA表達(dá)測定

采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測PC-3細(xì)胞bax、bcl-2 m RNA表達(dá)。將10、20、40μmol·L-1濃度的小白菊內(nèi)酯處理PC-3細(xì)胞48 h,用Trizol法收集PC-3細(xì)胞總RNA,之后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后用PCR法檢測bax、bcl-2 m RNA表達(dá)水平,以β-actin為內(nèi)參。PCR引物序列如下: β-actin上游引物:5'-CTACAATGAGCTGCGTGTGG-3';下游引物:5'-TAGCTCTTCTCCAGG GAGGA-3',擴(kuò)增片段長度450 bp;Bax上游引物:5'-TGCTTCAGGGTTTCATCCAG-3';下游引物:5'-GGCGGCAATCATCCTCTG-3',擴(kuò)增片段長度169bp;Bcl-2擴(kuò)增上游引物::5'-GCTCTGAACAGATCATGAAGACAG-3';下游引物:5'-CAATCCAAAGTGGACCTGAGG-3',擴(kuò)增片段長度746 bp。反應(yīng)條件:95oC預(yù)變性4 min,94oC 30 s,52oC30 s,72oC 60 s,循環(huán)30次;72oC 10 min,4oC holding。取出擴(kuò)增產(chǎn)物,利用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增結(jié)果,通過凝膠分析系統(tǒng)記錄分析,計算目的基因與內(nèi)參(β-actin)擴(kuò)增條帶光強(qiáng)度的比值,即得出目的基因m RNA相對表達(dá)的高低。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

運(yùn)用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±SD)表示,P<0.05被認(rèn)為結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小白菊內(nèi)酯抑制PC-3細(xì)胞的增殖

通過CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),高濃度小白菊內(nèi)酯對PC-3細(xì)胞的增殖有著明顯抑制作用,圖1所示,相比對照組,實(shí)驗(yàn)組隨小白菊內(nèi)酯濃度增加和作用時間的延長,PC-3細(xì)胞增殖能力受到顯著抑制。

圖1　各濃度小白菊內(nèi)酯孵育PC-3細(xì)胞24、48、72h后的增殖情況

2.2 小白菊內(nèi)酯促進(jìn)PC-3細(xì)胞的凋亡

經(jīng)不同濃度小白菊內(nèi)酯孵育PC-3細(xì)胞48 h后,使用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率,結(jié)果顯示:小白菊內(nèi)酯處理組(10、20、40μmol·L-1)PC-3細(xì)胞發(fā)生不同程度的凋亡,相比對照組細(xì)胞凋亡率均明顯升高,且隨藥物濃度的增加,凋亡率明顯上升,呈劑量依賴性關(guān)系,各實(shí)驗(yàn)組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05),見圖2。

圖2　各濃度小白菊內(nèi)酯孵育PC-3細(xì)胞48h后檢測其細(xì)胞凋亡率注:與對照組比較,*P<0.05

2.3 小白菊內(nèi)酯上調(diào)bax m RNA、降低bcl-2 m RNA表達(dá)

經(jīng)不同濃度小白菊內(nèi)酯孵育PC-3細(xì)胞48 h后,采用RTPCR檢測PC-3細(xì)胞的bax m RNA、bcl-2 m RNA表達(dá),結(jié)果顯示:相比對照組,小白菊內(nèi)酯組(10、20、40μmol·L-1)的PC-3細(xì)胞bax m RNA表達(dá)水平隨藥物濃度增高顯著上升(見圖3A),而bcl-2 m RNA表達(dá)水平隨藥物濃度增高明顯降低(見圖3B),兩者都呈劑量依賴性,各藥物組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P <0.05)。

圖3　(A)不同濃度小白菊內(nèi)酯處理PC-3細(xì)胞48h 后bax/β-actin的比值;(B)不同濃度小白菊內(nèi)酯處理PC-3細(xì)胞48h后bcl-2/β-actin的比值

3 討論

近年來,從植物中提取新的抗腫瘤藥物已成為研究的熱點(diǎn)[13]。小白菊內(nèi)酯是野甘菊中的主要成分,在西方國家用于治療偏頭痛、皮膚感染等疾病[14,15]。此外還有研究發(fā)現(xiàn),小白菊內(nèi)酯具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性,在體外可抑制多種腫瘤細(xì)胞株的生長增殖[9,10,11,12]。因此,小白菊內(nèi)酯作為一種植物來源的抗腫瘤藥物,研究其對人前列腺癌細(xì)胞PC-3凋亡的作用及其機(jī)制對其臨床應(yīng)用有著較為現(xiàn)實(shí)的意義。

CCK-8法是一種操作簡便、靈敏度高、步驟少,結(jié)果準(zhǔn)確可靠,重復(fù)性好的細(xì)胞活性檢測方法[16]。本研究發(fā)現(xiàn),使用CCK-8法檢測經(jīng)小白菊內(nèi)酯孵育后的PC-3細(xì)胞增殖活性隨著藥物濃度和時間的增加顯著降低,并且流式細(xì)胞儀檢測顯示小白菊內(nèi)酯處理組PC-3細(xì)胞發(fā)生不同程度凋亡現(xiàn)象,藥物濃度越高,凋亡率越高,呈劑量依賴性關(guān)系,這提示了小白菊內(nèi)酯抑制細(xì)胞增殖活性與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

凋亡,又稱程序性死亡,是由基因調(diào)控細(xì)胞衰老、維持機(jī)體正常運(yùn)行的重要機(jī)制,由一系列細(xì)胞內(nèi)外信號通路精密調(diào)控,各種凋亡信號通過信號傳導(dǎo)通路傳至細(xì)胞內(nèi),激活靶基因產(chǎn)生效應(yīng),引起凋亡[17],因此,細(xì)胞凋亡的失調(diào)常常會導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。已有的研究結(jié)果表明,線粒體是細(xì)胞凋亡的主要執(zhí)行者, 而bcl-2家族成員與線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑密切相關(guān)[18,19]。Bax和bcl-2基因都是bcl-2家族的主要成員,bax基因雖與bcl-2基因具有21%的同源性,作用卻相反,其表達(dá)產(chǎn)物與BCL-2蛋白結(jié)合并抑制其抗凋亡作用,進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的凋亡[20],而bcl-2基因是目前公認(rèn)的抗凋亡基因,通過抑制多種形式的細(xì)胞凋亡過程致細(xì)胞數(shù)目增加,對腫瘤細(xì)胞的增殖起促進(jìn)作用[17]。因此,bax m RNA表達(dá)增高可促進(jìn)細(xì)胞的凋亡,bcl-2 m RNA表達(dá)水平的下降可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在本研究中,隨著小白菊內(nèi)酯濃度的升高,PC-3細(xì)胞凋亡率明顯升高,促凋亡因子bax m RNA的表達(dá)明顯增高,抗凋亡因子bcl-2 m RNA的表達(dá)明顯下降。因此得出結(jié)論:小白菊內(nèi)酯通過上調(diào)bax mRNA的表達(dá)及降低bcl-2 m RNA的表達(dá)來誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞PC-3的凋亡,并呈一定的劑量依賴性。

4 結(jié)論

綜上所述,小白菊內(nèi)酯對前列腺癌PC-3細(xì)胞的增殖起顯著抑制作用,其機(jī)制可能與其誘導(dǎo)PC-3細(xì)胞凋亡及上調(diào)bax m RNA和降低bcl-2 m RNA的表達(dá)相關(guān),具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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Study on the possible mechanism of parthenolide on apoptosis ofhuman prostate cancer cells PC-3

Ai Jun
(Department of Surgical Oncology,The First People Hospital of Qujing,Yunnan Qujing 655000)

Abstract Objective:To explore the underlying mechanism responsible for parthenolide-induced apoptosis on human prostate cancer cell PC-3 in vitro.Methods:Human prostate cancer cell PC-3 were cultured in virto.Different concentrations of parthenolide (0,10,20 and 40μmol·L-1)were added to PC-3 cell.The inhibitory effect of parthenolide on PC-3 cell was determined by CCK8 assay,while apoptosis was analyzed by flow cytometry.Next,the m RNA levels of bax and bcl-2 were tested by RT-PCR.Results: After parthenolide treatment,CCK8 test indicated parthenolide could inhibit the proliferation of PC-3 cell(P<0.05).The increased apoptotic rates by parthenolide was found in PC-3 cell by flow cytometry(P<0.05).The results from RT-PCR suggested that parthenolide treatment contributed to the reduced bcl-2 mRNA level and the elevated bax m RNA expression in PC-3 cell.Conclusions: Parthenolide could significantly inhibit the proliferation of human prostate cancer cell PC-3 by induction of apoptosis,which may be associated with activating bax m RNA expression and inhibiting bcl-2 m RNA expression.

(收稿日期：2015-10-29)

作者簡介:艾俊,男,主治醫(yī)師,主要從事腫瘤藥理的研究,Email:ynqjha @163.com。