張建軍 季麗靜

(北京林業(yè)大學，北京，100083) (國家花卉工程技術研究中心(北京林業(yè)大學))

劉仲赫 周明潔 王雅麗 于曉南

(北京景山公園) (北京林業(yè)大學)

引進觀賞芍藥新種質的SSR指紋圖譜構建1)

張建軍 季麗靜

(北京林業(yè)大學，北京，100083) (國家花卉工程技術研究中心(北京林業(yè)大學))

劉仲赫 周明潔 王雅麗 于曉南

(北京景山公園) (北京林業(yè)大學)

采用SSR標記構建從歐美等地區(qū)引進、收集的61份觀賞芍藥新種質的指紋圖譜。根據引物的多態(tài)性信息含量和Shannon遺傳多樣性指數(shù)大小，從15對候選引物中篩選出10對多態(tài)性高且穩(wěn)定性好的引物作為核心引物，首次構建了61個觀賞芍藥新種質指紋圖譜，并編制了指紋代碼。結果表明：被試種質資源的倍型豐富，有一條帶、兩條帶，甚至出現(xiàn)了三條帶、四條帶；所繪制的圖譜能夠將所有品種(種)完全區(qū)分開。

芍藥新種質；SSR；引物；DNA指紋圖譜；品種鑒定

We used SSR markers to construct the fingerprint of 61 ornamental peony resources mainly collected from European and North American regions. With the polymorphism information and Shannon diversity indexes of primer, we selected 10 pairs of primers from 15 candidates as core primers with high polymorphism and good stability. Fingerprint of 61 new peony resources were first built and fingerprint code was compiled. The ploidy type were with rich varieties including one, two, three and four belts. The map could be used to distinguish all the cultivars (species), and identify the cultivars and ploidy diversity, and provides utility guideline for new peony resources.

芍藥自先秦以來就有記載，是深受我國人民喜愛的傳統(tǒng)名花[1]。其花容俏麗，花姿富貴，自古就有“花相”之譽[2]。在世界范圍內，芍藥也是廣受歡迎的優(yōu)良花卉，在西方園藝界，芍藥遠比牡丹享譽盛名[3-4]。隨著市場的開放，芍藥優(yōu)良的觀賞特性和切花品質逐漸為世界各地越來越多的人們認識，市場需求空前提高[5]。

芍藥種質資源豐富，從全世界范圍來看，按其種源組成不同分為中國芍藥品種群、歐洲芍藥品種群、雜種芍藥品種群三類[6-7]。與單一起源(Paeonia.lactiflora)的中國芍藥品種群相比，歐洲及雜種芍藥品種群混合了P.lactiflora以外的種源，文中的觀賞芍藥新種質，特指芍藥科(Paeoniaceae)芍藥屬(PaeoniaL.)芍藥組(Sect. Paeonia)中的多年生宿根花卉，它們均來自歐洲、美洲等地區(qū)，其親本混合了P.lactiflora以外的種源，很多原種或品種都曾作為重要親本參與了世界芍藥品種的培育，在觀賞特性和生態(tài)適應性方面表現(xiàn)優(yōu)異，極大豐富了芍藥屬種質資源。因而，在觀賞特性和生態(tài)適應性方面與單一起源的中國芍藥品種群有較大差異。然而，歐美芍藥品種由于長期育種栽培，遺傳背景復雜，加上大多品種收集者為苗圃主或園藝愛好者，有些品種育種年代久遠，育種記錄缺失等，使得親緣關系模糊，品種間的遺傳差異越來越小，僅僅依據形態(tài)進行品種間的田間檢測越來越困難。同時，由于形態(tài)鑒定的時效性差，容易受到環(huán)境和主觀因素的影響[8]，導致品種混淆的問題越來越突出，使得后續(xù)的育種及應用受到了較大的限制[9]。DNA指紋圖譜主要是指基于DNA基礎上的某一個品種區(qū)別于其他品種的特異性DNA片段[10]，因其簡單快速、準確可靠以及便于自動化等優(yōu)點，使得其在觀賞植物種質鑒定中受到廣泛的應用[11-13]。已經運用RAPD、SCAR、AFLP、SSR等分子標記手段成功開展了大量的研究[14-18]。與其他分子標記相比，SSR標記重復性與多態(tài)性好，在基因組中豐度較高，以孟德爾方式遺傳，呈現(xiàn)共顯性等優(yōu)點而在DNA指紋鑒定上顯示了其獨特的優(yōu)越性[19]。目前，指紋圖譜在觀賞芍藥中研究較少，僅朱紅霞等[20]運用AFLP技術開展過相關研究，而針對SSR標記進行指紋圖譜構建的研究還未有相關的報道。

本試驗通過SSR標記構建觀賞芍藥部分新種質指紋圖譜，為進行種質鑒定和品種倍性輔助分析提供了技術支持，也對理清芍藥品種親緣關系，科學利用新優(yōu)種質資源，推動育種工作的深入開展積累了研究基礎，具有重要意義。

1 材料與方法

所有61份芍藥新優(yōu)種質資源分別來自荷蘭、美國、加拿大、日本，目前均栽種于國家花卉工程研究中心(北京林業(yè)大學)芍藥種質資源苗圃中(北京，小湯山)和北京景山公園(表1)。

表1 芍藥新優(yōu)種質資源

DNA提?。荷炙庍z傳多樣性研究中采用不需要經過水浴和氯仿抽提的試劑盒法(天根，DP320)進行芍藥品種基因組DNA提取，操作步驟按說明書進行。提取芍藥基因組DNA后(圖1)，置于冰箱-20 ℃，備用。

M為DNA標記DL2000；1-6為芍藥葉片DNA提取效果。

引物篩選：利用聚丙烯酰胺凝膠電泳法對芍藥遺傳多樣性研究中運用磁珠富集法設計、開發(fā)的50對SSR引物進行多態(tài)性篩選(圖2)，初步篩選出來15對多態(tài)性引物(表2)作為進行指紋圖譜構建研究的候選引物。

圖2 多態(tài)性引物的篩選

熒光引物檢測：將開發(fā)的15對引物應用于61份材料，均擴增出清晰的條帶(圖3)。

SSR-PCR擴增：將所設計的引物進行PCR擴增反應，擴增反應采用優(yōu)化的25 μL體系。反應液中包括：17.8 μL ddH2O、2.5 μL 10×PCR buffer、1.7 μL MgCl2(2.5 mmol)、0.6 μL Forward primer(10 μmol)、0.6 μL Reverse primer(10 μmol)、0.5 μL dNTPs(2.5 mmol each)、1.0 μL模板DNA和0.3 μL Taq DNA聚合酶。反應程序為95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s；共35個循環(huán)。72 ℃延伸5 min；10 ℃保存待用。將V(PCR產物)∶V(98%甲酰胺+10 mmol EDTA ph8.0+0.25%溴酚藍+0.25%二甲苯青)=5∶5混合后迅速放入PCR儀中95 ℃變性5 min；分離取出變性產物立即放入冰水混合物中待用；插梳，采用排槍小心上樣，恒功率90 W電泳70 min。銀染檢測擴增產物。

表2 15對芍藥SSR標記引物序列(篩選后)

注：引物序號按微衛(wèi)星序列數(shù)1-63編號，列出的為重復序列8個以上可用于設計引物的50個微衛(wèi)星中篩選后的15個候選引物序列。

2 結果與分析

2.1 SSR標記多態(tài)性分析

2.2 指紋圖譜構建

根據引物多樣性信息篩選核心引物和SSR擴增產物在凝膠上的相對位置，參照宋紅梅等[21]、雷天剛等[22]的方法分別對引物與顯示的譜帶進行賦值，并按照數(shù)字與字母結合的方法排序，編寫指紋代碼(表4)，利用Excel2010版作圖工具，繪制了61個芍藥品種的DNA指紋圖譜。所構建的指紋圖譜能夠很好地代表各品種的特異性。

圖3 引物在不同個體內的熒光檢測

本試驗通過采用上述10對引物對61個芍藥品種(種)進行指紋分析。從繪制的指紋圖譜中可知，這些芍藥新種質不再是傳統(tǒng)意義上僅有一條帶、兩條帶的二倍體類型，而是出現(xiàn)了三條帶、四條帶。從細胞水平上可知，芍藥倍型非常豐富，已知的野生種中就有二倍體種，如P. lactiflora、P. tenunata、P. sterniana，四倍體種P. officinalis、P. dauricasubsp. macrophylla、P. peregrina等，故其品種的倍性必然也會多樣化。歐美地區(qū)培育芍藥新品種因其野生種源倍性的多樣化，其品種也呈現(xiàn)多樣性趨勢。‘Halcyon’在sy16、sy45、sy55等三條引物中表現(xiàn)三條帶；‘HenryBockstoce’在sy16、sy42、sy44、sy55四條引物中表現(xiàn)出三條帶；‘CreamDelight’在sy16、sy32、sy44、sy45、sy55等五條引物中也表現(xiàn)出了三條帶；‘Sunshine’在sy45、sy55兩條引物中表現(xiàn)出了四條帶。由此可以推測，‘Halcyon’‘CreamDelight’‘HenryBockstoce’和‘Sunshine’至少為三倍體或四倍體品種。引物sy45和sy55在‘Halcyon’‘HenryBockstoce’‘CreamDelight’‘Sunshine’4個多倍體品種上均表現(xiàn)出特征譜帶，表明這兩個引物多態(tài)性豐富的同時，特征譜帶也多，可考慮將這兩個多態(tài)性引物在構建指紋圖譜、進行品種鑒定時進行優(yōu)先應用。最終所繪制的圖譜能夠將所有被試品種(種)完全區(qū)分開來。

表3 特征引物的遺傳多樣性參數(shù)

表4 芍藥新種質的指紋代碼

續(xù)(表4)

3 結論與討論

SSR標記的指紋圖譜在親緣關系、品種及倍性鑒定等方面都具有較為廣泛的應用[23-25]。目前，在芍藥屬內開展的相關工作還不夠，僅朱紅霞[20]利用AFLP反應體系繪制了5個牡丹品種和6個芍藥品種的指紋圖，但遺憾的是，由于供試個體較少，研究結果很難真正反映芍藥、牡丹之間的遺傳背景，制約了后續(xù)相關研究的推進。本試驗以歐美引進的觀賞芍藥新種質為材料，在引種的過程中，經常會遇到“同物異名”或者兩個品種表型觀賞性狀非常相似、無法確定其真實身份的情況。這些情況說明了，在植物中開展從表型到DNA分子水平的多方位的種質研究和鑒定工作不僅是可能的，也是基于實際研究應用的需要。其中，通過開發(fā)分子標記，構建指紋圖譜是一條有效的途徑。

試驗通過獲得15個SSR位點上的遺傳多樣性信息并根據PIC多態(tài)性含量和Shannon遺傳多樣性指數(shù)大小信息，從15對候選引物中篩選10對特征引物，通過采用數(shù)字與字母結合排序的方法進行DNA指紋圖譜的構建，開創(chuàng)了運用新的可靠方法構建芍藥指紋圖譜進行種質鑒定和倍性分析的先例，突破了表型進行品種分類鑒定的瓶頸，為DNA指紋技術應用于芍藥種質鑒定奠定了應用基礎，為觀賞芍藥進行良種檢測以及保護育種者權益提供了一個有效的輔助分析手段。

由于開發(fā)標記的數(shù)目有限，同時也受到檢測技術的限制，開發(fā)SSR引物也存在一定的難度，本試驗提供的指紋圖譜是建立在10個特征引物的基礎之上的，引物個數(shù)畢竟太少，僅能體現(xiàn)部分特征。同時，構建的指紋圖譜主要以DNA的多態(tài)性為主，缺少表型形態(tài)數(shù)據。而且，一般品種倍性的確認主要是靠核型分析及染色體數(shù)目的分析，僅從分子水平上判斷其倍性證據不足，單純的指紋圖譜僅能作為判斷其倍性的一個輔助分析手段。為了豐富該指紋圖譜的信息，非常有必要加大試驗投入，不斷增加SSR位點數(shù)目及群體樣本個數(shù)，增加標記的方法和種類，加快各種新型標記方法(EST-SSR、cpSSR、nSSR、SRAP)的探索和應用，提高指紋圖譜的可靠性，不斷完善芍藥指紋圖譜系統(tǒng)。

致謝：感謝花卉種質創(chuàng)新與分子育種北京市重點實驗室(北京林業(yè)大學)為本試驗提供部分試驗條件。

[1] 汪菊淵.芍藥史話[J].世界農業(yè),1984(5):52-54.

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Constructing SSR Fingerprinting for Introduced New Germplasm ofPaeoniaL.

Zhang Jianjun(Beijing Forestry University, Beijing 100083, P. R. China); Ji Lijing(National Engineering Research Center for Floriculture); Liu Zhonghe, Zhou Mingjie, Wang Yali(Beijing Jingshan Park); Yu Xiaonan(Beijing Forestry University)/Journal of Northeast Forestry University，2015,43(3)：70-74.

New germplasms;PaeoniaL.; SSR; Primer; Fingerprinting; Identification of cultivars

1)中央高校基本科研業(yè)務費專項資金(YX2014-20)、國家自然科學基金項目(31400591)。

張建軍，男，1990年1月生，北京林業(yè)大學園林學院，碩士研究生。E-mail：zhang727jianjun@126.com。

于曉南，北京林業(yè)大學園林學院，教授。E-mail：yuxiaonan626@126.com。

2014年9月8日。

S682.1+2; Q343

責任編輯：任 俐。