牛志剛 王新新 吳亮,3 楊靜

（1中海油能源發(fā)展采油服務公司 天津 300452 2中海石油環(huán)保服務有限公司 天津 300452 3中國海洋大學環(huán)境科學與工程學院 山東青島 266100)

含油污泥是石油生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的一種重要的工業(yè)污染物，主要是由高濃度的石油烴和泥砂等成分組成的一種極為復雜的危險固體廢棄物。特別是其中含有的高濃度多環(huán)芳烴等有機烴類污染物具有強烈的致癌致畸致突變的“三致”效應，對生態(tài)環(huán)境穩(wěn)定和人體健康構(gòu)成了巨大威脅[1]。目前多環(huán)芳烴已被世界上多個國家和地區(qū)列為優(yōu)先控制污染物，因此急需快速有效的處理技術(shù)根治這類污染物。目前，超聲凍融法、表面活性劑洗脫和熱化學法等物理化學技術(shù)已經(jīng)大量應用于含油污泥的處理[2,3]。盡管物理化學處理技術(shù)具有速度快、效果好的優(yōu)點，但是處理費用過于昂貴并且容易造成生態(tài)環(huán)境的二次污染。生物處理方法利用生物的代謝活動將污染物逐漸降解，具有費用低廉和環(huán)境友好等突出優(yōu)點，因而受到各國科研人員的重視[4,5]。采用多環(huán)芳烴降解菌降解含油污泥中的多環(huán)芳烴是治理這一優(yōu)先控制污染物的有效方法[6]，因此有必要對其中含有的多環(huán)芳烴降解菌進行深入分析。然而，目前關(guān)于含油污泥中多環(huán)芳烴降解菌的分離并不多見。目前僅有Bacillus和Pseudomonas等多環(huán)芳烴降解菌生存在含油污泥中的報道[7]。因此，急需獲得更多的含油污泥多環(huán)芳烴降解菌菌株，以豐富降解菌資源。

本研究采用富集培養(yǎng)方法從典型含油污泥樣品中分離多環(huán)芳烴降解菌，綜合采用16SrRNA基因序列和生理生化方法對其進行鑒定，進一步分析其生長特性和降解特性，以期獲得含油污泥中多環(huán)芳烴降解菌多樣性的基本信息，為含油污泥的生物處理提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

采集某油田的典型含油污泥。采用常規(guī)分析方法分析該含油污泥樣品的全氮、有機質(zhì)、含水量、pH值和石油烴等基本理化性質(zhì)見表1。

表1 供試含油污泥的基本理化性質(zhì)

1.2 多環(huán)芳烴降解菌的富集和分離

取10g含油污泥放入90mL以多環(huán)芳烴萘、蒽、菲和芘為唯一碳源的無機鹽培養(yǎng)基中。于30℃搖床120r·min-1恒溫富集培養(yǎng)10d。吸取10mL富集培養(yǎng)液，接種到90mL新鮮的無機鹽培養(yǎng)基中。不斷重復上述操作，富集培養(yǎng)3次。從含有以多環(huán)芳烴萘、蒽、菲和芘為唯一碳源的無機鹽培養(yǎng)基平板上采用稀釋平板涂布法分離純化單菌落[8]。

1.3 多環(huán)芳烴降解菌的鑒定

將分離獲得的純菌株接種到TSB培養(yǎng)基上，觀察記錄菌落形態(tài)并進行革蘭氏染色。采用Omega細菌DNA提取試劑盒和Omega瓊脂糖凝膠回收試劑盒提取純化菌株基因組DNA。采用細菌16SrRNA通用引物27F和1492R進行PCR擴增，并進一步純化[9]。采用ABI3730XLDNAanalyzer進行測序。將得到的序列用BLAST程序與GenBank+EMBL+DDBJ+PDB數(shù)據(jù)庫進行比對，手動下載相似性較高的16SrRNA序列，并采用ClustalW程序進行多序列對齊。采用MEGA4.0軟件的Neighbor-Joining方法和Jukes-Cantor模型進行系統(tǒng)發(fā)育分析，重復取樣1000次進行自展值分析[10]。該菌株16SrRNA序列的登錄號為：KM525670。采用常規(guī)方法進一步進行生理生化鑒定分析。

1.4 多環(huán)芳烴降解菌的生長特性和降解特性

分別以10%的接種量將菌液接種到以石油烴、正十六烷、多環(huán)芳烴萘、菲、蒽和芘為唯一碳源的無機鹽培養(yǎng)基中，30℃搖床120r·min-1恒溫培養(yǎng)15d。以不添加碳源的接菌培養(yǎng)基作為空白對照，測定各培養(yǎng)液的OD600，以考察菌株對烴類底物的利用能力。采用氣相色譜法測定殘留多環(huán)芳烴的含量，考察菌株對多環(huán)芳烴的降解能力[9]。

1.5 統(tǒng)計分析

采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對測試數(shù)據(jù)進行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 多環(huán)芳烴降解菌的分離

通過富集馴化和分離純化等步驟，經(jīng)過初篩復篩，得到一株多環(huán)芳烴降解菌W13020。該菌株在TSB培養(yǎng)基上的菌落呈淺黃色，表面濕潤，略透明，邊緣整齊、菌落圓形，扁平。顯微觀察革蘭氏染色陰性，細胞呈桿狀。采用16SrRNA序列分析對其進行鑒定，進行系統(tǒng)發(fā)育分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖1所示。菌株W13020與嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌Stenotrophomonas maltophilia MTCC 434T的同源性高達99.0%，高于其他模式菌株。采用常規(guī)方法進一步進行生理生化鑒定分析，結(jié)果如表2所示。該菌株可耐受4%NaCl，生長pH值5~9，可以利用土溫80、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露糖和果糖。產(chǎn)生蛋白酶和DNA酶，而不產(chǎn)生氧化酶和脲酶。具有明膠液化和硝酸鹽還原能力，H2S和甲基紅實驗陰性。結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果和生理生化分析結(jié)果，該菌株可被鑒定為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌Stenotrophomonas maltophilia。

圖1 多環(huán)芳烴降解菌W 13020 的系統(tǒng)發(fā)育樹

表2 多環(huán)芳烴降解菌W 13020 的生理生化特征

1960年Hugh R等[11]發(fā)現(xiàn)并命名了嗜麥芽假單胞菌（Pseudomonasmaltophili）。1983年Swings J等[12]通過表型數(shù)據(jù)分析又將其命名為嗜麥芽黃單胞菌（Xanthomonasmaltophili）。1993年P(guān)alleroni NJ等[13]再一次將其命名為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonasmaltophilia）。Carmody LA等[14]通過對766株嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌進行詳細的生理生化分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這種菌的生理生化特征具有明顯的多樣性，這也印證了對該菌的鑒定具有一定困難。我們通過16S rRNA序列分析發(fā)現(xiàn)，菌株W13020與StenotrophomonasmaltophiliaMTCC 434T的同源性高達99.0%，并且生理生化分析結(jié)果與模式菌株基本一致。因此，將菌株W13020鑒定為嗜麥芽黃單胞菌Stenotrophomonasmaltophilia是可靠的。

采用氣相色譜法分析多環(huán)芳烴降解菌W13020對4種多環(huán)芳烴的降解率，結(jié)果如圖2所示。W13020菌株對萘、蒽、菲和芘的15d降解率分別為72.1±3.7%、45.1±15.6%、42.2±5.2%和31.2±9.0%，說明W13020菌株對多環(huán)芳烴具有明顯的降解能力。其中，該菌對萘的降解率顯著（P<0.05）高于其它3種多環(huán)芳烴，說明該菌對低分子量多環(huán)芳烴的降解能力較強。此外，該菌株不能利用正十六烷，但是可以利用石油烴為唯一碳源和能源生長。這可能是由于該菌利用石油烴里的多環(huán)芳烴組分造成的。Stenotrophomonas maltophilia的多環(huán)芳烴降解能力多有報道。Gao S等[15]從雜酚油污染土壤中分離得到了一株Stenotropho monasmaltophilia C6，并深入研究了該菌株降解菲的降解途徑，識別了22個中間代謝產(chǎn)物。Chen S等[16]發(fā)現(xiàn)Stenotropho monasmaltophilia在銅離子存在的情況下仍然可以降解苯并芘。Urszula G等[17]從活性污泥中分離得到了一株Stenotropho monasmaltophilia KB2，可以降解苯酚和兒茶酚等單環(huán)芳烴，并具有兒茶酚1,2-雙加氧酶活性。然而，具有多環(huán)芳烴降解能力的Stenotropho monasmaltophilia并未發(fā)現(xiàn)存在于含油污泥中。本研究通過富集培養(yǎng)從含油污泥中分離得到了一株可以降解萘、蒽、菲和芘的Stenotrophomonas maltophilia W13020，證實了Stenotropho monasmaltophilia也生存于含油污泥的環(huán)境中。

圖2 多環(huán)芳烴降解菌W 13020 對4 種多環(huán)芳烴的降解率

3 結(jié)語

本研究從含油污泥中分離得到一株多環(huán)芳烴降解菌W13020。采用16S rRNA基因序列和生理生化方法將其鑒定為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌Stenotrophomonasmaltophilia。該菌株可以利用石油烴、多環(huán)芳烴萘、菲、蒽和芘為唯一碳源和能源生長，對萘、蒽、菲和芘等多環(huán)芳烴具有明顯的降解能力。

[1]Mesquita SR,van Drooge BL,Reche C,et al.Toxic assessment of urban atmospheric particle-bound PAHs:relevance of composition and particle size in Barcelona (Spain)[J].Environ Pollut,2014,184:555-562.

[2]Zhang J,Li J,Thring RW,et al.Oil recovery from refinery oily sludge via ultrasound and freeze/thaw[J].JHazard Mater,2012,203:195-203.

[3]Jin Y,Zheng X,Chu X,etal.Oil recovery from oil sludge through combined ultrasound and thermochemical cleaning treatment[J].Ind Eng Chem Res,2012,51(27):9213-9217.

[4]Koolivand A,Naddafi K,Nabizadeh R,et al.Biodegradation of petroleum hydrocarbons of bottom sludge from crude oil storage tanks by in-vessel composting[J].Toxico Environ Chem,2013,95(1):101-109.

[5]王新新,韓禎,白志輝,等.含油污泥的堆肥處理對微生物群落結(jié)構(gòu)的影響[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報,2011,30(7):1413-1421.

[6]Vitte I,Duran R,Hernandez-RaquetG,etal.Dynamics of metabolically active bacterial communities involved in PAH and toxicity elimination from oil-contaminated sludge during anoxic/oxic oscillations[J].Appl Microbiol Biotechnol,2013,97(9):4199-4211.

[7]Dhote M,Juwarkar A,Kumar A,et al.Biodegradation of chrysene by the bacterial strains isolated from oily sludge[J].World J Microbiol Biotechnol,2010,26(2):329-335.

[8]Wang XX,Li C,Zhao LB,et al.Diversity of culturable hydrocarbons-degrading bacteria in petroleum-contaminated saltern[J].Adv MatRes,2014,1010:29-32.

[9]王新新,白志輝,金德才,等.石油污染鹽堿土壤翅堿蓬根圍的細菌多樣性[J].微生物學通報,2011,38(12):1768-1777.

[10]Tamura K,Dudley J,NeiM,etal.MEGA4:molecular evolutionary genetics analysis(MEGA)software version 4.0[J].Mol Biol Evol,2007,24(8):1596-1599.

[11]Hugh R,Ryschenkow E.Pseudomonas maltophilia,an Alcaligenes-like Species[J].JGen Microbiol1961,26:123-132.

[12]Swings J,De Vos P,den Mooter MV,et al.Transfer of Pseudomonas maltophilia Hugh 1981 to the Genus Xanthomonas as Xanthomonas maltophilia(Hugh 1981)comb.nov[J].Int JSyst Bacteriol,1983,33(2):409-413.

[13]Palleroni NJ,Bradbury JF.Stenotrophomonas,a new bacterial genus for Xanthomonas maltophilia(Hugh 1980)Swingsetal.1983[J].Int J Syst Bacteriol,1993,43(3):606-609.

[14]Carmody LA,SpilkerT,LiPumaJJ.Reassessment of Stenotrophomonas maltophiliaphenotype[J].JClin Microbiol,2011,49(3):1101-1103.

[15]Gao S,Seo J-S,Wang J,et al.Multiple degradation pathways of phenanthrene by Stenotrophomonas maltophilia C6[J].Int Biodeterior Biodegradation,2013,79:98-104.

[16]Chen S,Yin H,Ye J,etal.Effect of copper(II)on biodegradation of benzo[a]pyrene by Stenotrophomonas maltophilia[J].Chemosphere,2013,90(6):1811-1820.

[17]Urszula G,Izabela G,Danuta W,etal.Isolation and characterization of a novel strain of Stenotrophomonas maltophilia possessing various dioxygenases for monocyclic hydrocarbon degradation[J].Braz J Microbiol,2009,40(2):285-291.