劉雪來 高 鵬 綜述 黃格元 審校

①(香港大學深圳醫(yī)院外科，深圳 518053)②(香港大學李嘉誠醫(yī)學院外科學系，香港 999077)③(哈爾濱市兒童醫(yī)院外科，哈爾濱 150010)

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·文獻綜述·

皮膚角朊細胞的三維培養(yǎng)*

劉雪來①②高 鵬③綜述 黃格元①②審校

①(香港大學深圳醫(yī)院外科，深圳 518053)②(香港大學李嘉誠醫(yī)學院外科學系，香港 999077)③(哈爾濱市兒童醫(yī)院外科，哈爾濱 150010)

表皮角朊細胞(keratinocyte，KC)是皮膚創(chuàng)傷后“再上皮化”過程中的主要功能細胞，其增殖和移行是創(chuàng)緣皮膚早期修復的重要生物學過程[1，2]。在體內外環(huán)境下探索和檢測各種分子類藥物、納米顆粒材料等對KC增殖、移行和分化的功效以及創(chuàng)傷后組織結構和功能的快速修復，是微創(chuàng)治療的熱點研究內容之一[3]。KC的培養(yǎng)作為開展相關研究工作的前提，因其在體外環(huán)境貼壁性差，細胞活力低，增殖緩慢，對培養(yǎng)要求相對嚴格，成為創(chuàng)傷修復研究的難點。

當前人們主要采用體外二維培養(yǎng)擴增KC，而近年來隨著三維(three-dimensional，3D)細胞培養(yǎng)技術的興起，國內外學者亦嘗試對KC進行3D培養(yǎng)并取得成功，為人工皮膚制備提供了技術支持。本文對此進行綜述。

1 皮膚角朊細胞采用3D培養(yǎng)的原因

對于表皮KC的體外培養(yǎng)，研究者所關心的不僅是KC能否在體外環(huán)境下有效生長，還有分裂增殖和歷經(jīng)多次傳代后的KC能否依舊保持在體狀態(tài)的原有性狀[4]。在皮膚表皮內具有增殖活力的KC主要位于棘層和基底層，其增殖和分化受到基因表達的調控，其在轉錄水平的調控尤為重要，這些經(jīng)過調控的KC經(jīng)過一系列形態(tài)學和生化改變，最終進入角質層形成角質細胞。表皮本身是KC生長的內環(huán)境，對于基因調控KC的增殖和分化至關重要。此外，各種細胞外基質和細胞因子等也對KC生長產(chǎn)生重要影響。這些提示：傳統(tǒng)二維培養(yǎng)與體內環(huán)境之間存在著較大的生物學差異(表1)。

傳統(tǒng)二維培養(yǎng)技術使細胞僅可以在平面內單層生長，無法更好地模擬體內微環(huán)境，影響了基因精確表達調控，使KC在體外培養(yǎng)環(huán)境下生長過程中逐漸喪失原有性狀特征。以皮膚創(chuàng)傷修復研究為例，各種藥物分子、分子載體、靶基因(蛋白)的激活劑或阻斷劑，以及干細胞在局部應用之后，研究者只能借助觀察傷口面積大小改變情況來判定外源因素對傷口愈合的影響，觀察結果只代表藥物的最終效果，無法呈現(xiàn)包括對“再上皮化過程”的影響或“再上皮化過程”對“真皮收縮”影響的“修復中間過程”。因此，人們認識到在傳統(tǒng)的體外二維細胞培養(yǎng)和體內研究之間，應該存在一種新的細胞培養(yǎng)技術，這種技術：①不但能有效培養(yǎng)KC，使細胞在生長傳代的同時能保持自然形態(tài)和功能，以及良好的體內生物學性狀特征，而且有助于人們觀察和了解KC的代謝、分化、增殖、發(fā)育和移行等過程，以及對全皮膚組織構建的影響；②貼近體內真實環(huán)境，為臨床研究提供科學依據(jù)；③保證細胞的活力和對外界因素的敏感性[5]；④有助于了解KC在培養(yǎng)體系(模擬皮膚組織)內的相互作用和影響；⑤規(guī)避動物皮膚燒傷、燙傷等模型制備過程中的倫理學問題。在這種情況下，3D培養(yǎng)KC技術應運而生，其對KC的培養(yǎng)較傳統(tǒng)二維培養(yǎng)優(yōu)勢明顯，并更貼近人體內環(huán)境條件(表1)。通過應用具有三維結構的材料作為載體與KC在體外共同培養(yǎng)，使KC能夠在載體特有的立體結構中增殖、遷移和生長，形成類似皮膚表皮結構，即培養(yǎng)體系立體結構與皮膚切面結構相似。

2 皮膚角朊細胞3D培養(yǎng)的探索演化過程

對KC的3D培養(yǎng)經(jīng)歷了較長的探索過程。正常皮膚表皮含有8～10層KC，呈立體排列，因此人們力圖探索和培養(yǎng)出形態(tài)學上與成人表皮結構相近的含有數(shù)層KC的組織。最初采用3T3細胞種植于膠原蛋白表面，其上種植KC[6]，即以3T3細胞為飼養(yǎng)層，KC在培養(yǎng)皿底呈單層平面性生長；此后又探索將3T3細胞混入膠原蛋白來模擬真皮組織，其上種植KC[7]。2種培養(yǎng)方法均可產(chǎn)生分別具有增殖和角化特性的數(shù)層KC，被視為3D培養(yǎng)KC和制備人工皮膚的早期雛形。

表1 傳統(tǒng)二維培養(yǎng)、三維培養(yǎng)和體內環(huán)境對角朊細胞生物學行為的影響

人體皮膚的真皮來源于中胚層，與外界隔離且有血管組織，細胞外液豐富；表皮來源于外胚層，暴露于干燥的外界環(huán)境且無血管組織，細胞連接緊密。為使KC的生長環(huán)境更接近人體正常生理狀態(tài)，人們進一步探索出氣-液界面培養(yǎng)法，借助氣-液界面使3D培養(yǎng)KC最大程度地接近正常人體皮膚[8]。操作時在培養(yǎng)皿內加上一層鋪墊，鋪墊可以是動物皮膚真皮組織，生物水化劑膠體，生物纖維片，膠原蛋白膜，有機尼龍網(wǎng)，或膠原蛋白與有機尼龍網(wǎng)的貼合物。對鋪墊物先進行浸泡性培養(yǎng)，然后再將皮膚KC接種其上，加入的培養(yǎng)液不超過鋪墊水平，細胞通過鋪墊吸收營養(yǎng)。KC在接種一定時間后，將鋪墊物升到氣-液面繼續(xù)培養(yǎng)，在這種環(huán)境下，鋪墊物始終暴露于類似細胞外液環(huán)境下，而表層KC暴露于氣-液界面之間，此環(huán)境有助于KC完成終末分化并形成多層細胞，從上層細胞到底層細胞含有分布不等的角蛋白[9，10]。氣-液界面培養(yǎng)法培養(yǎng)KC可生長出多層類似正常皮膚的表皮細胞層次。檢測某些生化指標發(fā)現(xiàn)，其與正常皮膚非常相近，如脂類物質的合成，具有對水的屏障功能[11]。

隨著真皮組織替代物培養(yǎng)材料的不斷革新，近年來人們開始采用各類納米級高分子蛋白質支架和降解材料來包被和模擬真皮組織成分，并且可以添加各種促進KC增殖和分化的成分到納米支架內，調控KC生長使其處于不同細胞周期和代謝狀態(tài)[12]。此外，人們也選用可降解性材料作為真皮組織替代物進行KC的3D培養(yǎng)之前的包被，這些可降解生物材料可在有限的空間內最大程度地培養(yǎng)KC并有助收集細胞過程中的純化和提取，且不影響細胞的活力和增殖特性[13]。

當前，KC的3D培養(yǎng)變得更加便捷，一些商業(yè)化3D培養(yǎng)產(chǎn)品在生產(chǎn)和制備過程中已包被成各種基質蛋白，及其他一些常用的細胞培養(yǎng)基質，包括Ⅰ型膠原、Ⅳ型膠原、層粘連蛋白、纖維粘連蛋白、多聚賴氨酸、Matrigel等[14]，并已實現(xiàn)了在3D培養(yǎng)產(chǎn)品內對KC的培養(yǎng)和皮膚表皮層的構建[15]。因此法便捷、安全，可靠，實驗數(shù)據(jù)能更貼近體內環(huán)境，當前已成為3D培養(yǎng)KC的首選。

3 皮膚角朊細胞3D培養(yǎng)常用模式介紹

3D細胞培養(yǎng)是將細胞種植在細胞外基質或細胞外基質替代物所構建的立體培養(yǎng)體系內，培養(yǎng)體系內網(wǎng)眼狀細胞外基質成分為細胞生長構建出三維結構支架，使細胞能在該立體空間結構內增殖、遷移、分化[16，17]，即采用立體結構來模擬細胞生長的體內環(huán)境。皮膚組織KC的3D培養(yǎng)突出的優(yōu)勢在于細胞外基質或細胞外基質替代物本身為KC的貼壁提供了理想環(huán)境。無論是來自原代細胞還是細胞系，KC在體外環(huán)境貼壁性差，細胞活力低，增殖緩慢，傳統(tǒng)二維培養(yǎng)方法需要采用各種手段先促進KC貼壁才能進一步生長，例如在二維細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基內添加各種生物成分，或采用射線照射滅活的3T3成纖維細胞為飼養(yǎng)層，以及鼠尾膠涂層技術，為KC提供貼壁環(huán)境[1,18]。而在3D細胞培養(yǎng)體系內，其存在的細胞外基質本身就是KC貼壁和生長的物質基礎，KC能夠在更接近體內真皮組織環(huán)境下快速貼壁。該技術是一種在形態(tài)上仿生人體皮膚結構，并在立體層面構建和培養(yǎng)擁有數(shù)層表皮KC的培養(yǎng)方法。

當前，3D培養(yǎng)體系種類繁多。按培養(yǎng)體系的外觀結構可以分為培養(yǎng)板和細胞小室兩類(圖1)。培養(yǎng)板上培養(yǎng)的細胞通常在細胞外基質構建的支架上方生長，細胞只接受來自培養(yǎng)體系上部的營養(yǎng)，適于短期培養(yǎng)細胞；細胞小室是目前最常用的3D培養(yǎng)體系，是在培養(yǎng)板基礎上加裝了小室(chamber)以方便懸掛培養(yǎng)，支架內的細胞可在兩個方向接受營養(yǎng)，方便更換下部的培養(yǎng)板從而使實驗用途增大，可用于細胞在氣-液交界面上進行培養(yǎng)和共培養(yǎng)研究，適于長期細胞培養(yǎng)和研究。作為廣泛應用的3D培養(yǎng)體系，細胞小室按體系內細胞外基質支架與培養(yǎng)基之間的毗鄰關系分為氣-液交界3D培養(yǎng)，常規(guī)3D培養(yǎng)和兩種培養(yǎng)基3D培養(yǎng)三種方式(圖2)。對于氣-液交界3D培養(yǎng)，細胞外基質支架的底部與培養(yǎng)基接觸，基質借助虹吸作用吸收培養(yǎng)基，營養(yǎng)其內細胞并使細胞在氣-液之間生長。該培養(yǎng)方式主要用于各種上皮細胞(包括皮膚KC)的培養(yǎng)，由于處于氣-液之間，KC在增殖、移行和分化過程中上部KC可出現(xiàn)角化現(xiàn)象，并構成了表皮組織的外表面，進一步模擬和構建出其下KC生長的體內環(huán)境；對于常規(guī)3D培養(yǎng)，培養(yǎng)板和小室內培養(yǎng)基相通，基質支架和其內生長的細胞浸沒于培養(yǎng)基內。對于KC培養(yǎng)而言，該方法適用于長期大規(guī)模培養(yǎng)以快速擴增細胞數(shù)量，而傳統(tǒng)二維細胞培養(yǎng)所從事的實驗研究，該方法也可實現(xiàn)且兩者之間沒有差異；對于兩種培養(yǎng)基3D培養(yǎng)，培養(yǎng)板和小室內的培養(yǎng)基不相通，基質支架內生長的細胞可以浸沒于兩種不同的培養(yǎng)基，該方式適于檢測不同條件下藥物分子或細胞因子通透分析和評定。

3D培養(yǎng)模式的多樣化為不同層面研究提供了條件。近年來，人們借助3D細胞培養(yǎng)模型，結合不同的3D培養(yǎng)方式以及所培養(yǎng)細胞的種類，開發(fā)出細胞共培養(yǎng)技術并將單純的3D細胞培養(yǎng)功能進一步擴展，實現(xiàn)了對細胞不同生物學過程和功能的分析和檢測。以KC為例，研究者可在細胞外基質支架內的不同層面培養(yǎng)不同類型的細胞，模擬多種細胞構建和優(yōu)化表皮和皮膚符合組織結構的可行性(圖3A和B)，檢測不同培養(yǎng)基、藥物分子，細胞因子和分泌化學因子對KC的作用，和對細胞信號通路的影響和干擾情況，以及蛋白質組學研究，檢測不同類型的細胞對KC的影響和表型轉化情況(圖3C和D)，研究KC在不同細胞間穿透和遷移能力，以及在“上皮-間充質轉化”中的單一生物學效果或作用(圖3E和F)。

圖1 3D培養(yǎng)板和細胞小室的剖面圖。培養(yǎng)板僅接受來自培養(yǎng)體系上部營養(yǎng)(箭頭)；細胞小室因懸掛培養(yǎng)可以在2個方向接受營養(yǎng)(箭頭) 圖2 細胞小室的不同培養(yǎng)方式剖面圖。藍色顯示小室內與培養(yǎng)板內不同類型的培養(yǎng)基 圖3 3D細胞共培養(yǎng)的模式和類別。共培養(yǎng)模式的多樣化使人們研究不同生物學過程和功能成為可能。粉色示培養(yǎng)基，紅色和藍色分別示不同類型的細胞

4 皮膚角朊細胞在3D培養(yǎng)中具備的優(yōu)勢

3D細胞培養(yǎng)是以細胞外基質蛋白為生長支架，使細胞在保證活力和增殖能力的基礎上，迅速貼壁生長并能夠分化產(chǎn)生一定的三維組織特異性結構[19，20]。該細胞外基質支架所創(chuàng)建或營造的細胞生長環(huán)境，因可以最大程度地模擬體內環(huán)境保證了KC體內生長時所具備的形態(tài)和表型特征，相關實驗數(shù)據(jù)和結果更能真實反應出KC在體內環(huán)境下某一生物學過程中的生物學效果或作用。

皮膚KC的3D培養(yǎng)有助于了解在正常和病理條件下組織修復時“上皮-間充質轉化”過程中的單一生物學過程。早期的“上皮-間充質轉化”在傷口愈合(特別是真皮收縮過程)中更是起到至關重要的作用。表皮層的KC及其前體細胞在創(chuàng)傷后因處于應激狀態(tài)，在較短時間內發(fā)生表皮-真皮之間的改變，KC向棘細胞層和真皮層移行并發(fā)生表型轉化，轉化后的KC在功能上具備真皮內成纖維細胞的特點，形成“上皮-間充質轉化”并分泌產(chǎn)生表皮層內的膠原，該過程不僅介導了表皮祖細胞的增殖和分化，也激活了其后的組織重塑。借助3D細胞培養(yǎng)，可有效排除復雜體內環(huán)境因素的干擾，借助不同類別的3D細胞共培養(yǎng)模式(圖3)，可直接演示“上皮-間充質轉化”單一過程中的表型和分子學改變情況，以及單一條件或因素對該過程的影響，也有助于闡明正常和病理條件下KC的結構和功能之間的改變情況和相互關系。

皮膚KC的3D培養(yǎng)有助于在體外環(huán)境下了解KC之間，KC與細胞外基質和生長因子，KC表面受體和配體之間的關系。KC的3D培養(yǎng)不但促進了細胞本身的貼壁性，其模擬的體內細胞生長環(huán)境保證了細胞與培養(yǎng)環(huán)境之間的相互作用，因此，該培養(yǎng)體系有助于在體外環(huán)境下研究以KC為中心的相關細胞學過程、大分子蛋白與KC之間的相互作用。此外，對靶分子和下游蛋白功能的描述，可在體外環(huán)境下先進行基因或蛋白質修飾(借助分子雜交、小RNA干擾技術或轉基因手段)，進而進入3D培養(yǎng)體系內，在不同培養(yǎng)階段清晰觀測細胞形態(tài)和功能改變情況，確認生物學功能的變化，彌補在轉基因動物研究中無法實現(xiàn)的形態(tài)觀測研究。以皮膚KC的3D培養(yǎng)為例，上述對單一生物學過程中分子功能的研究，不但有助于探索不同修復過程的分子學變化，尋找創(chuàng)傷修復的分子學開關，也可進一步上溯到表皮祖細胞的研究，有助于確認表皮祖細胞不同亞型，不同發(fā)育階段分子標志物的形成情況，也可有助于探索表皮祖細胞向短暫擴增細胞、KC和終末角化細胞分化的分子學依據(jù)，以及用于組織工程學模擬理想皮膚結構的相關研究。

5 皮膚角朊細胞在3D培養(yǎng)用于治療的微創(chuàng)前景和價值

如前所述，皮膚KC的3D培養(yǎng)，提供了一種有效培養(yǎng)KC的技術，并使其在生長傳代的同時能保持自然形態(tài)和功能，以及良好的體內生物學性狀特征，這為皮膚嚴重損傷，包括大范圍撕脫傷、皮膚嚴重燒傷和糖尿病皮膚組織的缺損，提供了可在短期內迅速擴增、具有較高質量的表皮細胞來源，而充足的KC和更加貼近表皮底層環(huán)境的KC是保證創(chuàng)傷修復過程中快速“再上皮化”的關鍵因素。

此外，過去人們多采用動物皮膚組織來模擬和制備人工皮膚。由于表皮層內無血管，其代謝主要依賴來自真皮的細胞外基質，但是在其移植和生長過程中，宿主血管需要為快速增值和移行的KC提供大量的營養(yǎng)，尤其是處于“表皮舌”部位的KC，通常會與宿主真皮血管直接接觸，這加劇了移植物排斥反應。采用皮膚KC的3D培養(yǎng)，能根據(jù)受損表皮和真皮的厚度，調控3D培養(yǎng)下的KC的厚度，是移植皮膚更貼近正常皮膚的形態(tài)特征；此外，可采用人體或患病個體的KC進行3D培養(yǎng)，這在一定程度上較少了修復過程中的免疫排斥，使修復過程更加迅速，修復后的組織外觀更加美觀。同時，該方法也有助于規(guī)避動物皮膚治療燒傷、燙傷過程中的倫理學問題。

不僅如此，利用3D細胞培養(yǎng)模式的可調控性，人們在進行皮膚KC的3D培養(yǎng)過程中可適時在培養(yǎng)體系內添加細胞因子、分子藥物等，也可以通過與納米支架的聯(lián)合應用來改變培養(yǎng)基的成分、質地和組織結構，從而最大程度地優(yōu)化皮膚組織修復中的“上皮-間充質轉化”過程，使修復或再生的皮膚組織具有輕微的瘢痕組織結構和良好的彈性、韌度，最大程度地實現(xiàn)“無瘢痕修復”治療的目的。

6 展望

3D細胞培養(yǎng)技術作為二維細胞培養(yǎng)與動物實驗之間的橋梁，具有細胞培養(yǎng)的形態(tài)學直觀性及培養(yǎng)條件可控性的優(yōu)勢，該培養(yǎng)技術正越來越得到廣泛接受和使用。對于皮膚KC的3D培養(yǎng)技術，其無論是在研究表皮發(fā)育、模擬和優(yōu)化人工皮膚，還是在皮膚移植領域，均可呈現(xiàn)傳統(tǒng)二維細胞培養(yǎng)所不具備的優(yōu)勢。筆者認為，該技術用于細胞培養(yǎng)僅僅是其部分功能，與其他綜合技術的廣泛結合和相互滲透(包括再生醫(yī)學、干細胞技術和材料科學)并有效促進3D培養(yǎng)體系最大程度接近和模擬人體組織和生化環(huán)境，才能進一步拓寬該技術在生物醫(yī)學領域的應用，而該技術的不斷優(yōu)化和成熟，并最終與轉化醫(yī)學的有效結合將更好地造福于病患。

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(修回日期：2014-10-30)

(責任編輯：王惠群)

哈爾濱市科技創(chuàng)新人才研究專項(青年后備人才)基金項目(2014RFQGJ158)

R329.2+8

A

1009-6604(2015)02-0185-05

10.3969/j.issn.1009-6604.2015.02.028

2014-07-23)

**通訊作者，E-mail：kkywong@hku.hk