閔曉黎，王廷勇，劉 佳，王廷華

缺血性腦血管疾病的發(fā)病率逐年上升，具有高致死率和致殘率的特點(diǎn)［1］，嚴(yán)重危害人類生命和健康，帶來沉重經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。腦缺血發(fā)生后，由于腦血流中斷導(dǎo)致局部供血區(qū)域缺血缺氧而促發(fā)一系列復(fù)雜的病理生理學(xué)變化，包括氧化應(yīng)激、鈣超載、興奮性氨基酸毒性、膠質(zhì)細(xì)胞活化［2］、炎性反應(yīng)［3］等，最終引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡、不可逆性死亡，出現(xiàn)嚴(yán)重神經(jīng)功能缺損。進(jìn)一步深入探討腦缺血的病理發(fā)生機(jī)制，尋找潛在干預(yù)靶點(diǎn)，可為臨床制定有效治療、預(yù)防策略提供理論依據(jù)，具有深遠(yuǎn)臨床意義。

胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor-1，IGF-1)屬于神經(jīng)營養(yǎng)因子(neurotrophic factors，NTFs)大家族中的一員，參與了腦缺血后的神經(jīng)保護(hù)作用。然而，在腦缺血發(fā)生后IGF-1 的表達(dá)變化模式究竟是上調(diào)還是下調(diào)，目前不同研究對此眾說不一，同時，對IGF-1 在永久性局灶性腦缺血中所涉及的細(xì)胞內(nèi)信號通路及其下游作用蛋白的研究也不完善。因此，本實(shí)驗(yàn)通過檢測MCAO 永久性局灶性腦缺血大鼠大腦皮質(zhì)中IGF-1 的表達(dá)變化，以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子MEK、ERK 和CREB 的活化情況，來證實(shí)IGF-1 是否通過MEK/ERK/CREB 信號通路發(fā)揮其功能，進(jìn)一步探討IGF-1 在腦缺血病理生理過程中的作用及作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組 健康成年雄性SD 大鼠62 只，體重220～250 g，購自四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，隨機(jī)分為MCAO 永久性局灶性腦缺血組(CI 組，n=31)和假手術(shù)組(Sham 組，n=31)，每組5 只用于mNSS 評分、5 只用于TTC 染色、5 只用于TUNEL 檢測、8 只用于qRT-PCR 檢測、8 只用于Western blot 檢測，具體分組情況及實(shí)驗(yàn)動物用途(見表1)。所有動物實(shí)驗(yàn)操作均得到四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)院動物倫理委員會(M43-07)批準(zhǔn)和認(rèn)可。

表1 實(shí)驗(yàn)動物分組及用途

1.2 MCAO 永久性局灶性腦缺血模型制備3.6%水合氯醛腹腔注射麻醉，1 ml/100 g。將大鼠仰臥固定于鼠板上，頸部備皮，75%酒精消毒，剪開頸部皮膚，組織鑷鈍性分離各層皮下組織，分離暴露出頸總、頸內(nèi)和頸外動脈，將頂端加熱成球面的MCAO 單絲尼龍線栓(直徑0.34 cm±0.02 cm)沿頸外動脈插入，進(jìn)入頸內(nèi)動脈直至大腦中動脈(MCA)起始處阻斷其血流，進(jìn)線深度距離頸總動脈分叉處約18 mm。然后縫線固定線栓外側(cè)端，縫合皮下組織和皮膚，局部碘伏消毒，維持大腦中動脈閉塞，造成永久性局灶性腦缺血。術(shù)后腹腔注射青霉素2 ×104U/(kg·d)。假手術(shù)組大鼠僅將MCAO 線栓插入至右側(cè)頸內(nèi)動脈起始端，其余步驟全部同腦缺血組大鼠。

1.3 樣本獲取 實(shí)驗(yàn)組和假手術(shù)組大鼠于術(shù)后48 h，用3.6%水合氯醛(1 ml/100 g)腹腔內(nèi)注射麻醉，斷頭取腦，取材新鮮完整全腦沿冠狀位切成2 cm厚度的切片用于TTC 染色，取材缺血同側(cè)大腦皮質(zhì)后放入冰凍切片機(jī)中切成5 μm 厚度的切片用于TUNEL/DAPI 免疫熒光染色，取材新鮮缺血同側(cè)大腦皮質(zhì)即刻凍存于-80 ℃?zhèn)溆糜趒RT-PCR 和Western blot 檢測IGF-1 及相關(guān)下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的基因和蛋白質(zhì)表達(dá)變化。

1.4 神經(jīng)功能評價 參照mNSS(modified Neurological Severity Score)評分標(biāo)準(zhǔn)，分別于術(shù)后6 h、12 h、24 h 和48 h，對所有實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評分。評分項(xiàng)目包括運(yùn)動功能、感覺功能、行走測試、平衡測試、反射缺失和反常運(yùn)動?？偡?8 分，1～6 分為輕度損傷;7～12 分為中度損傷;13～18 分為重度損傷。評分人員經(jīng)過培訓(xùn)且不參與模型制作，每只大鼠由3 名受過專業(yè)培訓(xùn)的評分人員分別進(jìn)行盲評。

1.5 TTC 染色 新鮮完整全腦取出后放入腦切片模具，-20 ℃迅速冷凍10 min，至不軟不硬適合切片為宜。沿冠狀位自腦前極至后極均勻切成厚度為2 cm 的厚片，浸入2%TTC(三苯基氯化四氮唑)溶液中37 ℃避光孵育30 min。至染色均勻后，取出染色的腦片，用4%多聚甲醛溶液固定，拍照觀察腦梗死程度和范圍。

1.6 TUNEL/DAPI 免疫熒光染色 缺血同側(cè)皮質(zhì)新鮮腦組織冰凍切片采用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記(TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)法染色觀察組織細(xì)胞在凋亡過程中細(xì)胞核DNA 斷裂情況，按照羅氏熒光原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(in situ cell death detection kit，TMR red，Roche 公司，德國)的操作步驟進(jìn)行。簡言之，新鮮腦組織切片經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定后，用0.1 mol PBS 溶液漂洗5 min ×3 次，3%過氧化氫常溫封閉15 min，添加新鮮制備的0.1% Trion X-100 +0.1%檸檬酸鈉常溫打孔10 min，PBS 漂洗5 min ×3次，添加酶液:標(biāo)記液=1∶ 9 的TUNEL 反應(yīng)混合物避光孵育4 ℃過夜。再用PBS 漂洗5 min ×3 次，滴加DAPI 室溫孵育5 min 復(fù)染細(xì)胞核。蓋玻片封片，熒光顯微鏡(Leica，CM1860，德國)下觀察組織細(xì)胞凋亡情況并采集熒光圖像，每張切片隨機(jī)選取5 個視野，使用Image-Pro Plus 6.0 軟件(MediaCybernetics 公司，美國)計(jì)數(shù)TUNEL 陽性凋亡細(xì)胞百分比。

1.7 實(shí)時熒光定量PCR 檢測 取實(shí)驗(yàn)組缺血同側(cè)大腦皮質(zhì)和sham 組對應(yīng)大腦皮質(zhì)，采用Taqman 探針法實(shí)時熒光定量PCR 檢測IGF-1，MEK，ERK 和CREB 的基因表達(dá)量。根據(jù)RNA 提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Qiagen 公司，美國)說明書將組織裂解抽提總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 第一鏈。然后以cDNA 鏈為模板，在ABI 7000 PCR 儀(Applied Biosystems 公司，美國)上進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件如下:94 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性10 s，51 ℃退火30 s，60℃延伸30 s，循環(huán)40 次。引物序列為:β-actin(227 bp):上游引物5'GTAAAGACCTCTATGCCAACA3’，下游引物5'GGACTCATCGTACTCCTGCT3’;MEK (758bp):上 游 引 物 5'TGACGCAGAAGCAGAAGGTG 3’，下游引物5'AGGTCGGCTATCCATTCCAT 3’;ERK(382 bp):上游引物5＇'TCAAGCCTTCCAACCTCCT 3’，下游引物5'TGTTCCACGGCACCTTATTT 3’;CREB(792 bp):上游引物5'CAGATTGCCACATTAGCCC3’，下游引物5'TTCCCTGTTCTTCATTAGACG 3’。根據(jù)每個反應(yīng)的動力學(xué)曲線確定每個樣品管中熒光強(qiáng)度增量達(dá)到閾值時的循環(huán)數(shù)作為Ct 值，分別讀取各個樣本的待測基因與內(nèi)參照基因的Ct 值，與β-actin 進(jìn)行校正后，采用2-ΔΔCt法計(jì)算樣本中的每個待測mRNA 相對于內(nèi)參β-actin 基因的相對表達(dá)量。每個樣本進(jìn)行兩次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.8 Western blot 檢測 待測組織稱重后加入新鮮配制含有蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液，冰盒中勻漿，超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)粉碎，低溫離心12，000 rmp 15 min，提取組織總蛋白。取2 μl 進(jìn)行BCA 法蛋白質(zhì)濃度測定并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，剩余總蛋白液加入5 ×上樣緩沖液混勻后沸水浴5 min 變性。取等量蛋白液上樣于新鮮配制8%SDS/PAGE 凝膠電泳90 min后，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。TBST 液漂洗5 min，蛋白面向上浸沒于5%脫脂牛奶中室溫封閉2 h。加入一抗(濃度均為1∶ 500，CST 公司)4 ℃孵育過夜，抗體型號分別為:ERK(9102)、p-ERK1/2 (9101)、MEK(9146)、p-MEK(9127);β-actin(濃度1∶ 10000，Abcam 公司，美國)作為內(nèi)參。TBST 液漂洗5 min ×3次，水平鐘擺式搖床上室溫輕搖2 h 辣根過氧化物酶二抗孵育，再次漂洗TBST 液5 min ×3 次。之后，采用HRP-ECL 發(fā)光法，加入按比例稀釋混合的A、B 發(fā)光液，于凝膠成像儀采集圖像信息，使用Photoshop 6.0 軟件(Adobe 公司，美國)測定相對光密度值。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能缺損評分 腦缺血(CI)組大鼠于清醒后均出現(xiàn)神經(jīng)功能缺失體征，表現(xiàn)為運(yùn)動、感覺、平衡功能和生理反射不同程度受損，mNSS 評分于術(shù)后6 h 開始逐漸升高，至術(shù)后1 d 達(dá)峰，術(shù)后2 d仍維持在較高水平。假手術(shù)(Sham)組大鼠mNSS 評分一直處于較低的水平，而腦缺血(CI)組大鼠各時間點(diǎn)的mNSS 評分均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于Sham 組，組間比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＜0.01，見圖1)。

2.2 TTC 染色觀察腦梗死范圍 新鮮腦組織冠狀位切片經(jīng)TTC 染色后，正常腦組織呈紅色，梗死區(qū)為蒼白色，與周圍正常腦組織分界清晰。Sham 組各腦片TTC 染色呈現(xiàn)均勻一致的紅色，而CI 組TTC 染色可見明顯大腦皮質(zhì)和皮質(zhì)下白色梗死區(qū)，梗死區(qū)域符合手術(shù)栓塞的大腦中動脈供血范圍(見圖2)。

2.3 TUNEL 檢測并計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞 TUNEL 染色陽性細(xì)胞在熒光顯微鏡下呈紅色熒光，凋亡細(xì)胞核固縮濃染，體積縮小，形態(tài)不規(guī)則。DAPI 染料可將腦組織內(nèi)所有細(xì)胞核染色，呈藍(lán)色熒光。觀察紅色熒光細(xì)胞與藍(lán)色熒光細(xì)胞核的重疊情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Sham組大腦皮質(zhì)未見明顯凋亡細(xì)胞，發(fā)紅色熒光的TUNEL染色陽性細(xì)胞數(shù)極少;而CI 組大腦皮質(zhì)則存在明顯凋亡，TUNEL 染色陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過Sham 組，組間比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＜0.01，見圖3)。

2.4 IGF-1 和MEK/ERK/CREB 信號分子mRNA 的表達(dá)變化 與Sham 組比較，大鼠MCAO 永久性局灶性腦缺血48 h 同側(cè)大腦皮質(zhì)中胰島素樣生長因子IGF-1 的mRNA 表達(dá)明顯下調(diào)(P ＜0.01);與此同時，細(xì)胞內(nèi)下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子MEK 的mRNA 表達(dá)明顯減少(P ＜0.01)，ERK 的mRNA 表達(dá)也比Sham組減少(P ＜0.05);核內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子CREB 的mRNA 表達(dá)也出現(xiàn)下調(diào)(P ＜0.05，見圖4)。

2.5 信號分子磷酸化蛋白的表達(dá)變化 通過Western blot 方法檢測各組細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子MEK 和ERK 的總蛋白及其各自磷酸化蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CI 組缺血同側(cè)大腦皮質(zhì)MEK 和ERK 的總蛋白表達(dá)水平均低于Sham 組(P ＜0.05)，磷酸化的MEK 和ERK1/2 蛋白表達(dá)水平更是明顯低于Sham 組(P ＜0.01，見圖5)。

3 討論

本研究中TTC 染色顯示實(shí)驗(yàn)組大鼠栓塞同側(cè)大腦皮質(zhì)及皮質(zhì)下區(qū)出現(xiàn)明顯白色腦梗死灶，與周圍紅色正常腦組織分界清晰。與此相對應(yīng)，實(shí)驗(yàn)組大鼠術(shù)后神經(jīng)功能出現(xiàn)不同程度受損，各時間點(diǎn)mNSS評分呈逐漸上升趨勢，且明顯高于假手術(shù)組。這些結(jié)果證實(shí)了我們的動物模型制備成功，可用于進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。另外，與假手術(shù)組比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠的缺血同側(cè)皮質(zhì)內(nèi)TUNEL 染色陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加，提示腦缺血引起了神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，與以往大多數(shù)研究結(jié)果一致［4］。

神經(jīng)營養(yǎng)因子(NTFs)是一大類小分子多肽或蛋白質(zhì)，由靶細(xì)胞合成分泌，并與其相應(yīng)受體結(jié)合，直接啟動效應(yīng)神經(jīng)元細(xì)胞和非神經(jīng)元細(xì)胞的存活、生長、分化等一系列生物學(xué)過程，而且還與神經(jīng)損傷、修復(fù)、免疫、炎癥［5］等密切相關(guān)，在腦缺血的病理發(fā)生機(jī)制中也發(fā)揮重要作用［6］。胰島素樣生長因子(IGF-1)屬于神經(jīng)營養(yǎng)因子大家族中的重要一員，參與了腦缺血后的神經(jīng)保護(hù)作用。然而，在腦缺血發(fā)生后IGF-1 的表達(dá)變化模式究竟是上調(diào)還是下調(diào)，目前不同研究并沒有得出一致性的結(jié)果。有研究顯示，腦缺血中防御性因子IGF-1 和攻擊性因子5-脂氧合酶(5-LO)同時發(fā)揮重要作用，二者在大鼠腦缺血再灌注24 h 時表達(dá)上升達(dá)高峰［7］。而在猴子MCAO 局灶性腦缺血24 h 時，缺血同側(cè)紋狀體內(nèi)IGF-1 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平均下調(diào)，但在海馬內(nèi)IGF-1 的mRNA 表達(dá)上調(diào)而其蛋白水平不變［8］。而在本研究中發(fā)現(xiàn)，大鼠MCAO 永久性局灶性腦缺血48 h 時，缺血同側(cè)皮質(zhì)內(nèi)IGF-1 的基因表達(dá)水平明顯下降。分析原因可能與各研究所使用的動物模型不同、檢測時間點(diǎn)不同有關(guān)，從而造成內(nèi)源性IGF-1在腦缺血不同部位的表達(dá)模式存在差異。

IGF-1 在腦缺血中主要起神經(jīng)保護(hù)作用，能夠減少細(xì)胞凋亡、促進(jìn)神經(jīng)元存活及其活力［9］、促進(jìn)神經(jīng)再生和新生血管形成［10］，從而減輕缺血性組織損傷、縮小腦梗死體積、改善缺損神經(jīng)功能恢復(fù)［11］。相反，若是降低IGF-1 的水平，則能通過抑制下游信號分子Akt 的磷酸化［12］，繼而抑制細(xì)胞周期蛋白D1(CCD1)的活化［16］，而減弱IGF-1 的促神經(jīng)元存活和促神經(jīng)祖細(xì)胞增殖的腦缺血后保護(hù)作用。本研究中實(shí)驗(yàn)組大鼠缺血皮質(zhì)IGF-1 水平明顯下降，而TUNEL 染色陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加，神經(jīng)細(xì)胞凋亡比假手術(shù)組明顯，提示IGF-1 的下調(diào)在局灶性腦缺血早期發(fā)揮負(fù)向調(diào)控作用。

本研究還發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)信號分子MEK(絲裂原激活蛋白激酶，mitogen-activated protein kinase)、ERK(細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶，extracellular signal-regulated kinase)的磷酸化蛋白水平在實(shí)驗(yàn)組大鼠缺血皮質(zhì)中明顯下降，提示MEK 和ERK 的活性受到抑制。目前，ERK 相關(guān)信號通路主要包括以下3 大類:(1)NTF →receptor →Grb2-sos →Ras →GTP →Raf-1 →MEK →ERK;(2)NTFs →receptor →PI3K →3'PI(PDK-1)→AKT →Raf-1 →MEK →ERK;(3)NTFs→receptor →PLC-γ →PKC →Raf-1 →MEK →ERK。可以看出，MEK 是ERK 的上游，如果MEK 的表達(dá)降低，將會引起ERK 的失活。本研究結(jié)果證實(shí)在MEK活性降低的同時，ERK 的活性也受到抑制。

已有文獻(xiàn)報道IGF-1 所發(fā)揮的腦缺血神經(jīng)保護(hù)作用主要通過活化下游PI3K/Akt［13～16］和ERK/MAPK［17］信號通路所介導(dǎo)，但是目前關(guān)于IGF-1 在永久性局灶性腦缺血中所涉及的細(xì)胞內(nèi)信號通路及其下游作用蛋白的研究尚不完善。CREB(cAMP response element-binding protein，cAMP 反應(yīng)元件結(jié)合蛋白)作為一個真核生物細(xì)胞核內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，結(jié)合在DNA 的CRE 元件上，促進(jìn)含有該元件的基因的轉(zhuǎn)錄，包括BDNF、bcl-2、c-myc、c-Jun 和絡(luò)氨酸羥化酶等。CREB 受多種激酶的激活，激活標(biāo)志是其133 位絲氨酸的磷酸化。磷酸化而激活的ERK也可以激活CREB。有實(shí)驗(yàn)表明大鼠局灶性腦缺血90 min/再灌注7 d 缺血半暗帶的ERK/CREB 信號通路被激活，通過下游BDNF 和VEGF 的增加，引起B(yǎng)rdU-NeuN 雙標(biāo)(+)的新生神經(jīng)元數(shù)量增多［18］。核外雌激素受體(ER)激活后能通過ERK/Akt/CREB/BDNF 途徑，減少全腦缺血大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的缺血性損傷。

圖1 大鼠mNSS 評分在不同時間點(diǎn)的變化趨勢

圖2 TTC 染色顯示腦梗死情況

圖3 大鼠皮質(zhì)TUNEL/DAPI 免疫熒光染色檢測細(xì)胞凋亡

圖4 大鼠腦缺血同側(cè)皮質(zhì)內(nèi)IGF-1 和下游信號分子MEK/ERK/CREB mRNA 的表達(dá)變化(* P ＜0.05 vs Sham，＊＊P ＜0.01 vs Sham)

圖5 大鼠腦缺血同側(cè)皮質(zhì)內(nèi)信號分子MEK 和ERK 1/2 及其磷酸化蛋白的表達(dá)變化

這些研究提示ERK/CREB 信號通路在腦缺血中主要發(fā)揮腦保護(hù)作用。本研究中不僅發(fā)現(xiàn)MEK和ERK 的mRNA 及其磷酸化蛋白表達(dá)水平下降，還發(fā)現(xiàn)CREB 基因的表達(dá)水平也隨之降低，提示失活的MEK/ERK 信號通路可能抑制了下游CREB 信號分子的活性。

CREB 上游激酶能被神經(jīng)營養(yǎng)因子及其受體所激活，因此我們推測IGF-1 也可能通過MEK/ERK/CREB 信號通路發(fā)揮作用。有研究使用雌二醇長期預(yù)處理或急性腦缺血后單獨(dú)腦室內(nèi)注射后處理，均可通過細(xì)胞內(nèi)雌激素受體激活后反式激活I(lǐng)GF-1 受體，再依次激活ERK、MAPK、CREB 信號分子，而挽救全腦缺血誘發(fā)的海馬CA1區(qū)瀕臨死亡的神經(jīng)元，減輕缺血所致的認(rèn)知功能缺損。然而，IGF-1 在永久性局灶性腦缺血中是否也能通過MEK/ERK/CREB信號通路發(fā)揮其促存活作用?本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)大鼠永久性局灶性腦缺血48 h 同側(cè)皮質(zhì)內(nèi)IGF-1 表達(dá)下降，p-MEK 和p-ERK 也減少，MEK 和ERK 的活性受到抑制，繼而下調(diào)了下游轉(zhuǎn)錄因子CREB 的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)證實(shí)了IGF-1 在永久性局灶性腦缺血中作用的發(fā)揮不僅能夠通過PI3K/Akt 等信號通路介導(dǎo)，也能通過MEK/ERK/CREB 信號通路介導(dǎo)。

綜上所述，永久局灶腦缺血早期大鼠皮質(zhì)內(nèi)IGF-1 的表達(dá)下調(diào)，通過負(fù)調(diào)控MEK/ERK/CREB 促存活信號通路，間接加重了腦缺血性損傷。

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