劉菁　劉學(xué)東　趙偉業(yè)　王毅　韓秀迪　呂森森　魏風(fēng)芹　王光艷

(1.山東省青島市市立醫(yī)院呼吸科， 山東青島　266000；2.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山東青島　266000)

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·論著·

吸入PM2.5顆粒與氣管內(nèi)滴注PM2.5混懸液建立大鼠慢性阻塞性肺疾病模型的比較

劉菁1劉學(xué)東1趙偉業(yè)1王毅1韓秀迪1呂森森1魏風(fēng)芹1王光艷2

(1.山東省青島市市立醫(yī)院呼吸科， 山東青島266000；2.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山東青島266000)

摘要目的：比較吸入PM2.5顆粒和氣管內(nèi)滴注PM2.5混懸液兩種方法構(gòu)建大鼠慢性阻塞性肺疾病(COPD)模型的效果。方法： 將30只Wistar大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(A組)、PM2.5煙熏組(B組)及PM2.5混懸液氣管內(nèi)滴注組(C組)。觀察不同時(shí)期大鼠的肺功能、支氣管肺泡灌洗液(BALF)中各類細(xì)胞計(jì)數(shù)及肺組織病理切片。結(jié)果：與A組比較，B組、C組大鼠的體質(zhì)量減輕；潮氣量(VT)、呼氣峰流速(PEF)減低；BALF中細(xì)胞總數(shù)、淋巴細(xì)胞數(shù)(L)、中性粒細(xì)胞數(shù)(N)增多，淋巴細(xì)胞比例(L%)、中性粒細(xì)胞比例(N%)增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。病理學(xué)觀察示，B組肺泡腔擴(kuò)大，部分肺泡間隔斷裂，肺泡融合，形成肺氣腫；氣道上皮細(xì)胞排列紊亂，部分氣道上皮細(xì)胞增生，出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)并且伴有平滑肌的增生，平均內(nèi)襯間隔(MLI)較A組增加，而平均肺泡數(shù)(MAN)較A組減少。C組和B組大鼠的病理改變相似，但C組病變程度更重，且以急性損傷為主。結(jié)論：吸入PM2.5顆粒較PM2.5氣管內(nèi)滴注建立的COPD模型更合理。

關(guān)鍵詞慢性阻塞性肺疾??；肺氣腫；PM2.5；動(dòng)物模型

近年來(lái)，我國(guó)的肺部疾病發(fā)生率呈增加趨勢(shì)。長(zhǎng)期暴露于顆粒物(PM)污染的空氣可增加發(fā)生肺部疾病的風(fēng)險(xiǎn)，如慢性阻塞性肺疾病(COPD)[1-3]。PM在呼吸道的沉積主要取決于顆粒的大小，較大的顆粒沉積在較大的氣道，較小的顆粒則可能滲透到肺泡腔。若顆粒物留在肺組織內(nèi)未能排出，則會(huì)導(dǎo)致炎性反應(yīng)。目前多通過(guò)氣管內(nèi)滴注PM2.5混懸液建立慢性支氣管炎、哮喘等動(dòng)物模型，而通過(guò)吸入含PM2.5的氣體而建立這些模型的研究則較少。本研究分別應(yīng)用吸入含PM2.5顆粒的氣體與氣管內(nèi)滴注PM2.5混懸液兩種方法構(gòu)建COPD大鼠模型，通過(guò)比較，尋求更符合COPD的病理生理及臨床實(shí)際的COPD動(dòng)物模型的建立方法。

1資料和方法

1.1動(dòng)物與試劑Wistar大鼠30只，雄性，體質(zhì)量(200±20) g，購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究所，許可證號(hào)：SCXK(京)2009-0017。HE染色試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物模型的建立將30只大鼠分為隨機(jī)分為3組：對(duì)照組(A組)、 PM2.5煙熏組(B組)、PM2.5混懸液氣管內(nèi)滴注組(C組)；每組10只。A組大鼠正常飼養(yǎng)，無(wú)特殊處理；B組大鼠置入PM2.5顆粒染毒箱內(nèi)，注入PM2.5顆粒，每日8 h；C組大鼠氣管滴注PM2.5混懸液，氣管滴注量8.0 mg/kg(體質(zhì)量)，每日染毒1次；給藥3個(gè)月。

1.2.2PM2.5顆粒的制備將煤、汽油、木屑的混合物充分燃燒，產(chǎn)生的氣體通過(guò)PM 10空氣過(guò)濾器，過(guò)濾后的氣體進(jìn)入煙熏染毒箱。用Sidepak AM510 型氣溶膠監(jiān)測(cè)儀(美國(guó)TSI公司)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)染毒箱內(nèi)的PM 2.5濃度，使其維持在500 μg/m3。

1.2.3PM2.5混懸液的制備從煤、汽油、木屑混合物燃燒產(chǎn)生的氣體中采用BGI公司PQ200型PM2.5采樣器采集PM2.5于玻璃纖維濾膜，浸入去離子水；然后將濾膜顆粒物超聲洗脫，洗脫液在4℃以12000 r/min離心，經(jīng)冷凍真空干燥后，保存于-20 ℃冰箱。使用前用0.9%氯化鈉液配置成相應(yīng)濃度的混懸液，并超聲震蕩混勻滅菌。

1.2.4肺功能監(jiān)測(cè)監(jiān)測(cè)肺功能，記錄30個(gè)呼吸周期，測(cè)定潮氣量(VT)、呼氣峰流速(PEF)、氣道內(nèi)壓上升坡度(IP)。

1.2.5外周血、支氣管肺泡灌洗液(BALF)的采集及血常規(guī)檢測(cè)大鼠腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛，取仰臥位固定。用聚維酮碘消毒頸部至腹部皮膚，剪開皮膚，分離腹主動(dòng)脈和靜脈，將采血針朝心臟方向刺入腹主動(dòng)脈，取血并檢測(cè)血常規(guī)。處死大鼠，分離頸部的皮膚及肌肉，將氣管及雙側(cè)肺門充分暴露，結(jié)扎右肺，切開氣管，將針頭插入左主支氣管，進(jìn)行肺泡灌洗，回收灌洗液，回收率80%。檢測(cè)BALF中的白細(xì)胞總數(shù)和分類，選取100個(gè)白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)，分別計(jì)算各類白細(xì)胞的絕對(duì)值及比例。

1.2.6肺組織的病理學(xué)檢測(cè)將右肺置于4℃磷酸鹽緩沖液中清洗血液后，于固定液中固定48 h；取右中肺進(jìn)行石蠟包埋、切片、HE染色。每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野，于100×及400×顯微鏡下觀察。計(jì)數(shù)每個(gè)視野內(nèi)肺泡數(shù)(Na)和肺泡間隔數(shù)(Ns)，測(cè)量每個(gè)視野面積(S)和十字線總長(zhǎng)(L)，平均內(nèi)襯間隔(MLI)=L/Ns，平均肺泡數(shù)(MAN)=Na/S。

2結(jié)果

2.1大鼠外觀及體質(zhì)量變化B組大鼠毛發(fā)失去光澤，活動(dòng)、進(jìn)食減少，間斷咳嗽、呼吸急促，體質(zhì)量較A組減輕；C組滴注PM2.5混懸液后，開始較煩躁，隨后有氣促、喘鳴，毛發(fā)無(wú)光澤、脫落，活動(dòng)能力下降，進(jìn)食明顯較少，體質(zhì)量明顯減輕。大鼠體質(zhì)量變化見表1。

表1　大鼠體質(zhì)量改變±s)

注：與A組比較，*P<0.01

2.2大鼠肺功能變化B組和C組VT、PEF均明顯低于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；B組和C組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表2　大鼠肺功能改變±s)

注：與A組比較，*P<0.01

2.3BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類與A組比較，B組和C組的BALF細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)(N)、淋巴細(xì)胞數(shù)(L)增多，中性粒細(xì)胞所占比例(N%)較高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．01)。B、C組之間細(xì)胞總數(shù)、N、L、N%差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

表3　BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類

注：與A組比較，*P<0.01

2.4大鼠肺組織的病理學(xué)結(jié)果與A組相比，B組大鼠的肺體積明顯增大，表面明顯蒼白，表面及切面可見褐色斑點(diǎn)。光鏡下可見B組的支氣管黏膜下腺體增生，有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，纖毛柱狀上皮層可見明顯增厚，杯狀細(xì)胞增生；支氣管管壁中性粒細(xì)胞聚集，黏液分泌增加，平滑肌增厚；有明顯肺泡腔擴(kuò)大、肺泡壁變薄、肺泡間隔破裂及肺泡腔融合，肺氣腫形成；見圖1~3。B、C組都有典型的COPD病理變化。B組主要表現(xiàn)為細(xì)支氣管壁的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡間隔變薄及斷裂，肺泡面積擴(kuò)大； C組主要表現(xiàn)為小支氣管黏膜損傷、管壁增厚，細(xì)胞鱗化，纖維組織增生，肺泡毛細(xì)血管出血、滲出，肺泡腔增寬，腔內(nèi)分泌物增多，中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤(rùn)，淋巴細(xì)胞增多。B組、C組肺組織的MLI均大于A組，而MAN均小于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，B組、C組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；見表4。

圖1　A組大鼠肺組織病理結(jié)果 (HE染色，×100)

呼吸性細(xì)支氣管、肺泡管、肺泡囊及肺泡可見明顯擴(kuò)大，肺泡間隔及肺泡壁結(jié)構(gòu)破壞斷裂，可見較多炎性細(xì)胞，部分的肺泡融合成肺大皰，支氣管、細(xì)支氣管的杯狀細(xì)胞明顯增生

圖2B組大鼠肺組織病理結(jié)果(HE染色，×100)

肺泡間隔、肺泡壁多處斷裂，局部炎性細(xì)胞浸潤(rùn)

組別MLI/μmMAN/(個(gè)/10mm2)A組32±0.55182±1.61B組57±0.65*97±1.24*C組54±1.47*105±1.28*

注：與A組比較，*P<0.01

3討論

COPD的臨床特點(diǎn)是不完全可逆的漸進(jìn)的氣流受限。氣流阻塞可導(dǎo)致其他疾病的發(fā)生，如缺血性心臟疾病、中風(fēng)、肺炎和肺癌[4-5]。吸煙(主動(dòng)或被動(dòng))是導(dǎo)致COPD的最重要原因， 此外，暴露于其他污染物，例如烹飪時(shí)燃料的燃燒、發(fā)動(dòng)機(jī)排放的尾氣、工業(yè)排放的廢氣等均與COPD的發(fā)生和加重有關(guān)[6-11]。目前，暴露于污染的空氣已成為全球范圍內(nèi)COPD發(fā)生的第二個(gè)主要因素。

PM2.5氣管內(nèi)滴注可直接破壞肺泡間隔的彈性纖維，導(dǎo)致肺泡腔擴(kuò)張，形成全小葉性肺氣腫。但這種方法造成的病變與COPD導(dǎo)致的肺氣腫的病理變化不完全相同，前者的病變往往分布不勻。若PM2.5的局部濃度過(guò)大，還易造成急性肺損傷，導(dǎo)致大鼠呼吸循環(huán)衰竭甚至死亡。而吸入PM2.5顆粒所致大鼠呼吸系統(tǒng)形態(tài)和功能的改變更符合COPD的特點(diǎn)。本研究結(jié)果表明，B、C組均出現(xiàn)肺內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、氣道壁增厚及肺泡腔的擴(kuò)大等COPD典型的病理改變，但C組的病變程度更重，且以急性肺損傷為主。 因此，吸入PM2.5顆粒較PM2.5氣管內(nèi)滴注更適合建立COPD動(dòng)物模型。

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Comparison of Establishing Rat Model of Chronic Obstructive Pulmonary Disease by Inhalation of PM2.5 or Intratracheal Instillation of PM2.5 Suspension

LIUJing1LIUXuedong1ZHAOWeiye1WANGYi1HANXiudi1LVSensen1WEIFengqin1WANGGuangyan2

1.DepartmentofRespiratory,QingdaoMunicipalHospital,Qingdao266000,China; 2.MedicalCollege,QingdaoUniversity,Qingdao266000,China

AbstractObjective：To compare the effect for establishing rat model of chronic obstructive pulmonary disease(COPD) between two methods, inhalation of PM2.5 and intratracheal instillation of PM2.5 suspension. Methods:A total of 30 adult rats were randomly divided into control group(group A), group fumigated with PM2.5(group B), and group instilled intratracheally with PM2.5 suspension(group C). Then the lung function of rats, the counts of inflammatory cells in bronchoalveolar lavage fluid(BALF), and the pathological sections of lung tissues, were observed on different phases. Results: Compared with that in group A，the body mass in group B or group C decreased. And the tidal volume(VT) and the peak expiratory flow(PEF) decreased. Furthermore, total cell count, lymphocyte count(L), neutrophil count(N), lymphocyte proportion(L%), and neutrophil proportion(N%) in BALF increased. All the differences showed statistical significance(allP<0.05). Morphological detection showed enlarged alveolar space, disruption of alveolar septa, fusion of alveoli, and formation of emphysema in group B. And it also showed disordered arrangement of airways epithelial cells, partial airway epithelial hyperplasia, inflammatory cell infiltration and proliferation of smooth muscle in group B. Furthermore, mean linear intercept (MLI) and mean alveolar number (MAN) in group B increased, while compared with that in group A. The pathological changes in group C were similar to those in group B. However, the degrees of pathological changes in group C were more severe, and most of them were acute injuries. Conclusions: Rat model of COPD established by inhalation of PM2.5 was more reasonable than that established by intratracheal instillation of PM2.5 suspension.

Key WordsChronic obstructive pulmonary disease；Emphysema；PM2.5；Model

通訊作者劉學(xué)東，E-mail:xuedongliu@263.net

中圖分類號(hào)R 563

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A