李麗萍　孔清　賴文盈　潘曉芬　伍偉鋒

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，廣西心血管病研究所，廣西南寧　530021)

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·論著·

Th1/Th2/Th17細(xì)胞因子及抗心肌抗體在小鼠擴(kuò)張型心肌病中的表達(dá)及其意義

李麗萍孔清賴文盈潘曉芬伍偉鋒

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，廣西心血管病研究所，廣西南寧530021)

摘要目的：觀察Th1/Th2/Th17細(xì)胞因子及抗心肌抗體在小鼠擴(kuò)張型心肌病(dilated cardiomyopathy，DCM)中的表達(dá), 并探討其在DCM發(fā)病機(jī)制中的作用及意義。方法： 用柯薩奇病毒 B3(CVB3)建立Balb/c小鼠DCM模型(DCM組)；對照組注射磷酸鹽緩沖液(PBS)。第24周處死小鼠，采用心肌Masson’s染色法觀察心肌組織纖維化程度；應(yīng)用蛋白芯片檢測血漿中Th1、Th2、Th17細(xì)胞因子的表達(dá)；采用ELISA方法檢測小鼠血漿中的抗心肌抗體，如抗線粒體內(nèi)膜ADP/ATP載體(adenine nucleotide translocator, ANT)抗體、抗β-肌球蛋白重鏈(β-myosin heavy chain, β-MHC)抗體、抗心肌L型鈣通道(cardiac L-type calcium channel, CACH2)抗體、β1 腎上腺素能受體(anti-β1-adrenergic receptor，β1AR)抗體的水平。結(jié)果：DCM組在病毒感染24周后的心肌病理檢查結(jié)果符合DCM特征；與對照組比較，DCM組血漿中白細(xì)胞介素(IL)-2、IL-10、IL-13、IL-28及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)表達(dá)下降，而IL-6、IL-17、IL-21、IL-22、IL-23及轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)的表達(dá)均明顯升高(P均<0.05)。同時(shí)，DCM組小鼠血漿中抗ANT及抗心肌β-MHC抗體較對照組明顯升高(P均<0.05)；相關(guān)性分析結(jié)果顯示，DCM組小鼠血漿中IL-22水平與抗ANT抗體水平呈正相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論：抗心肌抗體(如抗ANT抗體、抗β-MHC抗體)和Th1/Th2/Th17細(xì)胞因子(如IL-2、IL-10、IL-13、IL-28、TNF-α、IL-6、IL-17、IL-21、IL-22、IL-23)及TGF-β失衡導(dǎo)致的免疫紊亂可能在DCM發(fā)病中起重要作用，且IL-22可能促進(jìn)抗ANT抗體的產(chǎn)生。

關(guān)鍵詞細(xì)胞因子；抗心肌抗體；擴(kuò)張型心肌病

擴(kuò)張型心肌病(dilated cardiomyopathy，DCM)是一種臨床常見病，已成為僅次于缺血性心肌病和瓣膜性心臟病的第三大心力衰竭的病因[1-3]。迄今為止，尚未完全明確DCM的發(fā)病機(jī)制。自身免疫異常是DCM的發(fā)病機(jī)制之一，可以直接損傷心肌，啟動心室重塑，引起心臟形態(tài)和功能的變化[4- 5]。DCM發(fā)病過程中，細(xì)胞免疫的改變主要表現(xiàn)為T細(xì)胞功能變化及其細(xì)胞因子系統(tǒng)異常，如Th1、Th2、Th17細(xì)胞亞群及其細(xì)胞因子的改變[6- 7]。DCM發(fā)病過程中體液免疫異常主要表現(xiàn)為心肌特定抗原決定簇的自身免疫性抗體的異常表達(dá)。目前已知的抗心肌自身抗體(antiheart autoantibodies, AHAs)有抗線粒體內(nèi)膜ADP/ATP載體(adenine nucleotide translocator, ANT)抗體、抗β-肌球蛋白重鏈(β-myosin heavy chain, β-MHC)抗體、毒蕈堿乙酰膽堿受體 M2 (muscarinic acetylcholine receptor M2，CHRM2) 抗體、β1 腎上腺素能受體(anti-β1-adrenergic receptor，β1AR) 抗體、抗心肌L型鈣通道(cardiac L-type calcium channel, CACH2)抗體等[8-10]。除心臟移植外，目前仍無可以從根本上逆轉(zhuǎn)DCM心肌細(xì)胞損害的確切有效的治療手段，故DCM預(yù)后極差。本研究參考張召才等[11]的報(bào)道，以B3型柯薩奇病毒(coxsackie virus group B type 3,CVB3)重復(fù)感染Balb/c小鼠建立DCM動物模型，采用蛋白芯片技術(shù)檢測Th1/Th2/Th17細(xì)胞因子表達(dá)，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)技術(shù)檢測抗心肌抗體的水平，以期為DCM的免疫治療提供新的證據(jù)和思路。

1資料與方法

1.1材料4周齡SPF 級雄性Balb/c小鼠由國家嚙齒類實(shí)驗(yàn)動物種子中心湖南分中心提供(湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司)，許可證號：0062353-SCXK(X)2009-0004; CVB3由廣西醫(yī)科大學(xué)微生物教研室提供(Nancy株)；蛋白芯片購自美國RayBiotech公司。

1.2方法

1.2.1建立動物模型CVB3 Nancy 株經(jīng)人喉癌細(xì)胞系活化增殖，當(dāng)細(xì)胞病變程度達(dá)75%以上(+++～++++)時(shí)收獲，測得50%組織培養(yǎng)感染濃度 (TCID50)為10-7。隨機(jī)取15只雄性4周齡BALB/c小鼠，腹腔接種CVB3，制作DCM動物模型。具體方法為：首月腹腔接種含10-5/mL CVB3病毒的磷酸鹽緩沖液(PBS)0.1 mL，其后每月接種相同批次的CVB3，逐月遞增0.05 mL。另取7只雄性4周齡BALB/c小鼠，作為對照組，腹腔注射不含病毒的PBS。統(tǒng)計(jì)小鼠死亡數(shù)。于24周后處死組小鼠，眼眶采血并留取血漿；取心臟組織，用于Masson’s染色。

1.2.2心肌組織的病理學(xué)檢查取2組小鼠的心肌組織，用10%甲醛固定后石蠟包埋，然后進(jìn)行Masson’s染色, 在光鏡下觀察心臟的病理改變。采用Image-proplus 6.0軟件計(jì)算膠原容積積分(collagen volume fraction，CVF)，CVF =膠原面積/全視野面積×100%。

1.2.3血漿細(xì)胞因子的檢測嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，將芯片完全干燥，每個孔中加100 μL的樣品稀釋液，室溫在搖床上孵育30 min，封閉定量抗體芯片。吸出每個孔中的緩沖液后，加100 μL的標(biāo)準(zhǔn)液和樣品到各孔中，在搖床上孵育2 h后吸出每個孔中的標(biāo)準(zhǔn)液和樣品。用洗液反復(fù)清洗后，加入80 μL的檢測抗體至每個孔中，在搖床上室溫孵育2 h。用洗液反復(fù)清洗后，添加80 μL的Cy3-鏈霉親和素到每個孔中，避光，搖床上室溫孵育1 h。用洗液反復(fù)清洗，然后用荷蘭Axon公司GenePix激光掃描儀掃描，并采用QAM-TH17-1數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4血漿抗心肌抗體的表達(dá)水平檢測按試劑盒說明書，采用ELISA法分別檢測血漿中抗ANT、抗β-MHC、抗CACH2、抗β1AR抗體的水平, 檢測最低限分別為0.156 ng/mL、0.156 ng/mL、0.100 ng/mL、0.156 ng/mL。

2結(jié)果

2.1一般情況DCM組小鼠的生存率為66.7%(10/15)，對照組小鼠生存率為100%(7/7)。

2.2心肌組織的病理學(xué)檢查對心臟組織切片進(jìn)行Masson’s染色(圖1)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DCM組首次接種病毒24周后，心肌細(xì)胞排列明顯紊亂，藍(lán)色膠原明顯增多，心肌纖維束縱橫交錯而將心肌細(xì)胞呈島狀分隔開來，心腔較對照組明顯擴(kuò)大；對照組未見明顯纖維增生。

圖1　心肌組織Masson’s染色(×400)

2.3心肌組織的CVFDCM組CVF為(18.32±5.47)%，對照組為0，P<0.05。

2.4各組小鼠細(xì)胞因子的表達(dá)水平蛋白芯片分析結(jié)果顯示，DCM組小鼠的血漿白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-17、IL-21、IL-22、IL-23及轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)的表達(dá)量均高于對照組，而IL-2、IL-10、IL-13、IL-28及TNF-α均低于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而DCM組小鼠的血漿IL-1β、IL-4、IL-5、IFN、MIP-3a的蛋白表達(dá)水平與對照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1　 DCM組與對照組細(xì)胞因子的蛋白表達(dá)水平比較

2.5各組小鼠抗心肌抗體水平ELISA結(jié)果顯示，DCM組中血漿抗ANT抗體及抗β-MHC抗體的表達(dá)量均高于對照組(P<0.05)；DCM組抗CACH2抗體和抗β1AR抗體的含量與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2　小鼠血漿抗ANT抗體、抗β-MHC抗體、抗CACH2抗體、抗β1AR抗體表達(dá)量

2.6DCM組小鼠抗心肌抗體與IL-22水平的相關(guān)性分析相關(guān)性分析結(jié)果顯示，DCM組中血漿IL-22與抗ANT抗體水平呈正相關(guān)(R=0.856,P=0.031)，而與抗β-MHC抗體、抗CACH2抗體、抗β1AR抗體水平均無相關(guān)性(P均>0.05)。

3討論

DCM的發(fā)病機(jī)制迄今尚未完全闡明，心內(nèi)膜心肌活檢發(fā)現(xiàn)30%~40%DCM患者的心肌有慢性炎性反應(yīng)，其中病毒感染引起的心肌損傷及由此引發(fā)的免疫紊亂在DCM中發(fā)揮重要作用，且心肌炎和DCM被認(rèn)為是同一疾病的不同階段[12]。近年來，DCM中細(xì)胞因子和自身免疫抗體誘發(fā)的免疫反應(yīng)引起了研究者們的興趣，如IL-17、IL-22、ANT抗體、β1AR抗體等[10, 12-14]。這提示我們，DCM免疫紊亂是立體的、多層面的，涉及復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失衡。

Th1、Th2、Th17細(xì)胞是目前已知的參與DCM發(fā)病的重要T輔助細(xì)胞亞群，它們主要通過分泌細(xì)胞因子并形成細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)而在DCM中發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。本研究通過病毒重復(fù)增量感染的方法建立感染性DCM的小鼠模型[11,15]，并采用蛋白芯片技術(shù)分析Th1/Th2/Th17細(xì)胞因子在DCM中的表達(dá)情況。結(jié)果表明，與對照組比較，DCM小鼠血漿中IL-2、IL-10、IL-13、IL-28及TNF-α表達(dá)下降，而IL-6、IL-17、IL-21、IL-22、IL-23及TGF-β表達(dá)明顯升高。本研究與以前的一些相關(guān)研究[4, 10, 13- 14]的結(jié)果不完全一致，這可能是由不同的技術(shù)方法導(dǎo)致，本實(shí)驗(yàn)采用蛋白芯片技術(shù)，而以往研究多采用ELISA技術(shù)等。

本課題組的前期研究[10, 14]表明，抗ANT抗體和抗心肌β-MHC抗體參與小鼠病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)的發(fā)病 。VMC與DCM 屬于同一疾病的不同階段，參與兩者發(fā)病機(jī)制的抗心肌抗體是否有所不同呢？本研究表明，DCM組中血漿抗ANT抗體及抗β-MHC抗體的表達(dá)量均高于對照組，而DCM組抗CACH2抗體和抗β1AR抗體的含量與對照組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此提示，抗CACH2抗體和抗β1AR抗體可能并未參與DCM 的發(fā)病機(jī)制，而抗ANT抗體及抗β-MHC抗體可能參與了VMC及DCM發(fā)病機(jī)制?？笰NT抗體直接與心肌細(xì)胞線粒體ANT結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞能量代謝失調(diào)。此外，抗ANT抗體還能與心肌細(xì)胞漿膜上的鈣離子通道發(fā)生交叉反應(yīng)，引起心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載?？剐募ˇ?MHC自身抗體可特異性結(jié)合正常心肌肌球蛋白，引起心肌細(xì)胞炎性浸潤、壞死或凋亡，最終引起心肌收縮功能障礙、心力衰竭[10, 14]。本課題組發(fā)現(xiàn)，抗ANT抗體及抗β-MHC抗體在VMC及DCM中均明顯升高，兩者可能共同作用，參與了VMC向DCM進(jìn)展的過程。

有研究[16]在VMC患者中發(fā)現(xiàn)IL-17參與了VMC患者抗心肌抗體的產(chǎn)生過程。本課題組用IL-17A基因敲除小鼠進(jìn)行的試驗(yàn)也證明，IL-17A參與VMC小鼠抗ANT抗體的產(chǎn)生[10]。這些證據(jù)提示，細(xì)胞因子可能參與抗心肌抗體的產(chǎn)生。我們在DCM患者中發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)生IL-22的Th22細(xì)胞數(shù)量與ANT水平呈正相關(guān)，提示IL-22可能參與抗心肌抗體的產(chǎn)生。因此，我們進(jìn)一步探索了DCM小鼠血漿中IL-22與抗心肌抗體的相關(guān)性。結(jié)果顯示，DCM組中血漿IL-22與抗ANT抗體水平呈正相關(guān)，而與抗β-MHC抗體、抗CACH2抗體及抗β1AR抗體含量均無明顯相關(guān)性。這些結(jié)果提示，IL-22可能促進(jìn)了抗ANT抗體的的產(chǎn)生，抑制IL-22的表達(dá)，有可能會減輕DCM的免疫損傷，但其作用有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，除抗心肌抗體，如抗ANT、抗β-MHC抗體可能參與了DCM的發(fā)病外，Th1/Th2/Th17細(xì)胞因子如IL-2、IL-10、IL-13、IL-28、TNF-α、IL-6、IL-17、IL-21、IL-22、IL-23及TGF-β失衡導(dǎo)致的免疫紊亂亦可能在DCM發(fā)病中起重要作用，且IL-22可能促進(jìn)抗ANT抗體的的產(chǎn)生。這些表達(dá)異常的細(xì)胞因子及抗心肌抗體進(jìn)行的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)，可能為治療DCM提供新的思路和途徑。

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Expressions and Significance of Th1/Th2/Th17 Cytokines and Antimyocardial Antibodies in Mouse Dilated Cardiomyopathy

LILipingKONGQingLAIWenyingPANXiaofenWUWeifengDepartmentofCardiology,TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,GuangxiInstituteofCardiovascularDiseases,Nanning530021,China

AbstractObjective：To observe the expressions of Th1/Th2/Th17 cytokines and antimyocardial antibodies in mouse dilated cardiomyopathy (DCM), and explore their roles and significance in DCM pathogenesis. Methods:BALB/c mouse model of DCM was built with coxsackievirus(CVB3). Mice in control group were treated with phosphate-buffered saline (PBS) i.p. Mice were killed at the 24th week, and the fibrosis degree of myocardial tissue was observed by myocardial Masson’s staining. Expressions of Th1/Th2/Th17 cytokines in plasma were detected by using protein microarray. The mouse plasma levels of antimyocardial antibodies such as adenine nucleotide translocator(ANT) antibody, β-myosin heavy chain(β-MHC) antibody, cardiac L-type calcium channel(CACH2), and anti-β1-adrenergic receptor(β1AR) were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Results: The result of myocardial pathological examination in DCM group fit the features of DCM 24 weeks after virus infection. Compared with those in control group, expression levels of interleukin(IL)-2, IL-10, IL-13, IL-28 and TNF-α in DCM group decreased(P<0.05), however, the expression levels of IL-6, IL-17, IL-21, IL-22, IL-23 and TGF-β increased significantly(P<0.05). Meanwhile, compared with those in control group, the plasma levels of ANT and β-MHC antibodies in DCM group increased significantly (P<0.05). Furthermore, positive correlation was found between level of IL-22 and level of anti-ANT according to correlative analysis(P<0.05). Conclusions: Immunologic derangement induced by imbalance of antimyocardial antibodies such as ANT and β-MHC, and Th1/Th2/Th17 cytokines such as IL-2、IL-10、IL-13、IL-28、TNF-α、IL-6、IL-17、IL-21、IL-22、IL-23 and TGF-β may play important roles in the pathogenesis of DCM. Furthermore, IL-22 may boost the production of ANT antibody.

Key WordsCytokine;Antimyocardial antibody;Dilated cardiomyopathy

通訊作者伍偉鋒, E-mail: wucna65@163.com

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號：81160032)

中圖分類號R 542.2

文獻(xiàn)標(biāo)識碼A