駱 瑜，熊 瑋，楊純玉，梁 旭

易損斑塊是指具有破裂傾向、容易形成血栓導(dǎo)致急性心腦血管事件的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，又稱不穩(wěn)定斑塊［1］。斑塊的易損性或穩(wěn)定性是影響動(dòng)脈粥樣硬化患者預(yù)后的關(guān)鍵因素，需要早期發(fā)現(xiàn)，及時(shí)治療。miRNA (microRNA，miR)是一類長度21～29個(gè)核苷酸的小分子非編碼RNA，它們能夠識別特定的目標(biāo)mRNA，在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)調(diào)控基因表達(dá)，編碼超過30%的基因，與人類的生命活動(dòng)和疾病的發(fā)生關(guān)系十分密切［2］。miR-126 是內(nèi)皮細(xì)胞特異性的miRNA，它的缺乏會(huì)損害胚胎血管的完整性，使新生血管減少，導(dǎo)致血管的形態(tài)和功能出現(xiàn)改變，可能參與了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生及進(jìn)展［3］。本文通過研究頸動(dòng)脈粥樣硬化患者血液中miR-126 的水平變化，探討miR-126 與動(dòng)脈粥樣硬化及斑塊穩(wěn)定性之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對象 所有病例均來自于自2012 年7 月-2014 年12 月在我院就診的門診和住院患者。所有病例均為無血緣關(guān)系的華南地區(qū)漢族人群，經(jīng)相關(guān)檢查排除急慢性感染、手術(shù)、創(chuàng)傷、肝腎疾病、惡性腫瘤、類風(fēng)濕性疾病、繼發(fā)性高血壓、心力衰竭、心瓣膜病以及存在酗酒、服用避孕藥的患者。

1.2 研究方法

1.2.1 一般項(xiàng)目檢測 所有患者常規(guī)檢查血壓，連續(xù)測量3 次，取平均值作為該患者的血壓。測量身高(m)、體重(kg)，計(jì)算體重質(zhì)量指數(shù)(BMI)。所有受試者空腹8 h 以上于清晨取臥位肘靜脈血4 ml，-80 ℃保存待測。所有患者常規(guī)測定肝功能(GPT)、腎功能(血肌酐)、總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、空腹血糖(BG)、血尿酸(UA)、超敏C 反應(yīng)蛋白(hsCRP)。

1.2.2 頸動(dòng)脈彩色多普勒超聲檢查 采用飛利浦公司IE33 型彩色多普勒超聲顯像儀，由專人進(jìn)行檢查，探頭頻率7.5～10.0 MHz，常規(guī)檢查頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈。測量血管內(nèi)徑、頸動(dòng)脈內(nèi)中膜厚度(IMT)，觀察斑塊的部位、大小、形態(tài)、數(shù)量、回聲特點(diǎn)、血流信號、有無充盈缺損等。將IMT＞1.0 mm 定義為頸動(dòng)脈內(nèi)膜增厚;IMT ＞1.3 mm并明顯突出內(nèi)膜為頸動(dòng)脈斑塊形成。硬斑為斑塊呈強(qiáng)回聲;軟斑為斑塊呈中等或弱回聲，形態(tài)規(guī)則或不規(guī)則，內(nèi)膜向腔內(nèi)凸起，內(nèi)部結(jié)構(gòu)均勻或不均勻;混合斑形態(tài)介于硬斑及軟班之間。硬斑為穩(wěn)定性斑塊，軟斑和混合斑為不穩(wěn)定性斑塊。所有患者均連續(xù)測量每側(cè)頸動(dòng)脈3 次，取平均值計(jì)算IMT。

1.2.3 Real time PCR 檢測miR-146a 按照RNeasy Mini Kit 試劑盒(Qiagen 公司)說明書提取RNA，紫外分光光度儀(260/280)檢測RNA 濃度(1.8～2.0 者采用)，聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定總RNA 的純度。

cDNA 合成:按照miRCURY LNA Universal RT microRNA PCR 試劑盒(EXIQON 公司)說明書操作。取模板RNA 14 μl，Enzyme mix 2 μl，5 ×RT 緩沖液4 μl，總體積20 μl，于PCR 儀42 ℃1 h，95 ℃5 min進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。合成的cDNA 置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

熒光定量PCR:反應(yīng)體系20 μl，包括SYBR Green mix 10 μl，PCR primer mix 2 μl，稀釋的cDNA模板8 μl。反應(yīng)條件:95 ℃10 min，95 ℃10 s，60 ℃1 min，40 次循環(huán)。每標(biāo)本均做3 個(gè)復(fù)孔。以U6 作為內(nèi)參，放入7900 熒光定量PCR 儀中檢測，根據(jù)公式miR-146a 相對表達(dá)量=2-(ΔCt sample-ΔCt control)計(jì)算。miR-146a 上下游引物由EXIQON 公司合成。

1.2.4 藥物治療 對經(jīng)過頸動(dòng)脈超聲檢查診斷為頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的患者常規(guī)予瑞舒伐他汀20 mg 每晚一次口服，治療12 個(gè)月后復(fù)查頸動(dòng)脈超聲、血hsCRP 及血miR-126。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 12 軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，組間差異采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 在106 例患者中，男性71 例，女性35 例，年齡30～87 歲，平均(51.4 ±8.9)歲，其中正常組患者32 例，穩(wěn)定斑塊組40 例，不穩(wěn)定斑塊組患者34 例。3 組患者的平均年齡、血壓、BMI、GPT、血肌酐、血脂、血糖、血尿酸均無明顯差異(P ＞0.05)。與正常組相比，穩(wěn)定斑塊組患者的血hsCRP水平上升，但差異不明顯(P ＞0.05)，不穩(wěn)定斑塊組患者的hsCRP 明顯升高(P ＜0.05)(見表1)。

2.2 miR-126 表達(dá) 采用熒光定量PCR 的方法檢測外周血miR-126 的相對表達(dá)量，結(jié)果顯示，與正常組患者相比，穩(wěn)定斑塊組患者血液中的miR-126水平上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);不穩(wěn)定斑塊組患者外周血的miR-126 水平明顯升高，與正常組患者相比差異更加顯著(P ＜0.01)(見圖1)。

2.3 治療前后hsCRP 和miR-126 變化 在34例不穩(wěn)定型頸動(dòng)脈粥樣硬化患者中，完成隨訪16例。予瑞舒伐他汀治療12 個(gè)月后復(fù)查頸動(dòng)脈超聲，結(jié)果顯示11 例患者為穩(wěn)定型頸動(dòng)脈斑塊，5 例患者頸動(dòng)脈正常，好轉(zhuǎn)率達(dá)到100%。16 例患者治療前外周血hsCRP 為(7.9 ± 1.0)mg/L，治療后復(fù)查hsCRP 為(5.7 ±0.7)mg/L，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);16 例患者治療前外周血miR-126CT 值為(4.67 ±0.26)，治療后CT 值為(5.22 ±0.31)，與治療前相比，治療后miR-126 相對表達(dá)量明顯下降(P＜0.05)(見圖2)。

表1 3 組患者的臨床資料

圖1 不同患者外周血的miR-126 表達(dá)

圖2 與治療前相比ΔP ＜0.05

3 討論

小分子RNA 作為一個(gè)廣泛分布的重要的基因調(diào)節(jié)子，在機(jī)體的正常生長、發(fā)育、分化、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、疾病和死亡等生理和病理過程均發(fā)揮著重要作用。近年來，對miRNA 表達(dá)調(diào)控機(jī)制及其調(diào)控相關(guān)疾病如惡性腫瘤、病毒感染、炎癥和免疫性疾病、內(nèi)分泌及代謝性疾病以及作為基因靶向藥物的研究表明miRNA 不僅參與了疾病的發(fā)生發(fā)展，同時(shí)也可以作為疾病的生物學(xué)診斷標(biāo)志用于疾病的診斷，作為基因藥物可用于疾病的治療［4～6］。

miR-126 是血管特異性的miRNA［7］。研究發(fā)現(xiàn)，敲除斑馬魚的miR-126 基因后，胚胎血管的發(fā)育受損害，血管的完整性被破壞從而導(dǎo)致出血，該作用的發(fā)生與血管內(nèi)皮生長因子信號通路被抑制有關(guān)［3］。敲除小鼠的miR-126 基因后，血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移能力下降，血管完整性破壞導(dǎo)致容易發(fā)生出現(xiàn)出血和死亡，而缺乏miR-126 基因的成年小鼠因?yàn)樾呐K血管的缺陷而發(fā)生心肌梗死［3］。血流刺激是促進(jìn)血管形成的因素之一。在血流機(jī)械力的作用下，鋅指蛋白誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子klf2a 表達(dá)增加，促進(jìn)內(nèi)源性的miR-126 生成，miR-126 激活血管內(nèi)皮生長因子信號通路，促進(jìn)血管的生成和發(fā)育［8］。在心肌梗死的動(dòng)物模型研究發(fā)現(xiàn)，局部注射miR-126 可以促進(jìn)缺血心肌的血管再生，改善心肌的血液灌注［9］。血管細(xì)胞間粘附分子-1 被發(fā)現(xiàn)是miR-126 的靶基因之一，miR-126 通過抑制血管細(xì)胞間粘附分子-1 的表達(dá)，阻斷血液中的白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的粘附，參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生［10］。在冠心病導(dǎo)致的慢性心功能衰竭時(shí)循環(huán)miR-126 水平顯著下降，其水平與腦鈉肽負(fù)相關(guān)，隨著心功能改善，miR-126 水平上升，表明miR-126 亦可作為心衰的循環(huán)標(biāo)志物［11］。研究還發(fā)現(xiàn)冠心病患者的血液miR-126水平下降，miR-126 可能對冠心病進(jìn)行負(fù)調(diào)控［12］。以上研究表明miR-126 是維持血管正常結(jié)構(gòu)和功能的miRNA，與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展有關(guān)聯(lián)。

在本文中，我們研究了不同類型頸動(dòng)脈斑塊患者的血液miR-126 水平的變化。我們的研究結(jié)果表明，與正?；颊呦啾?，頸動(dòng)脈粥樣硬化患者的循環(huán)miR-126 水平上升(P ＜0.05)，而且隨著頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的進(jìn)展，由穩(wěn)定斑塊向不穩(wěn)定斑塊發(fā)展后，不穩(wěn)定斑塊患者的血液miR-126 水平上升更加明顯(P ＜0.01);在給予瑞舒伐他汀治療12 個(gè)月后，不穩(wěn)定型頸動(dòng)脈粥樣斑塊的患者的斑塊穩(wěn)定性均明顯好轉(zhuǎn)，同時(shí)外周血hsCRP 及miR-126 水平也明顯下降(P ＜0.05)，表明miR-126 可能參與了頸動(dòng)脈粥樣硬化的病理過程，但它在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的具體作用及機(jī)制需要進(jìn)一步驗(yàn)證和探討。

［1］Aloke V，Masataka N，Jagat N，et al.Concept of vulnerable/unstable plaque［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2010，30(7):1282-1292.

［2］Esteller M.Non-coding RNAs in human disease［J］.Nat Rev Genet，2011，12(12):861-874.

［3］Wang S，Aurora AB，Johnson BA，et al.The endothelial-specific microRNA miR-126 governs vascular integrity and angiogenesis［J］.Dev Cell，2008，15(2):261-271.

［4］Creemers EE，Tijsen AJ，Pinto YM.Circulating microRNAs:novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease［J］.Circ Res，2012，110(3):483-495.

［5］van Rooij E，Olson EN.MicroRNA therapeutics for cardiovascular disease:opportunities and obstacles［J］.Nat Rev Drug Discov，2012，11(11):860-872.

［6］Vickers KC，Rye KA，Tabet F.MicroRNAs in the onset and development of cardiovascular disease［J］.Clin Sci (Lond)，2014，126(3):183 -194.

［7］Wei Y，Nazari-Jahantigh M，Neth P，et al.MicroRNA-126，-145，and -155:a therapeutic triad in atherosclerosis［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2013，33(3):449 -454.

［8］Niscoli S，Stansley C，Walker P，et al.MicroRNA-mediated integration of haemodynamics and vegf signaling during angiogenesis［J］.Nature，2010，464(7292):1196-1200.

［9］Chen JJ，Zhou SH.Mesenchymal stem cells overexpressing MiR-126 enhance ischemic angiogenesis via the AKT/ERK-related pathway［J］.Cardiol J，2011，18(6):675-681.

［10］Harris TA，Yamakuchi M，F(xiàn)erlito M，et al.MicroRNA-126 regulates endothelial expression of vascular cell adhesion molecule 1［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2008，105(5):1516-1521.

［11］Fukushima Y，Nakanishi M，Nonogi H，et al.Assessment of plasma miRNAs in congestive heart failure［J］.Circ J，2011，75(2):336-340.

［12］鄭志偉，勞海燕，余細(xì)勇，等.冠心病患者血漿循環(huán)miR-126 的表達(dá)及其對血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響［J］.中國病理生理雜志，2011，27(12):2313-2317.