李世英，謝云亮，于忠慧

三七(panax notoginseng)為我國傳統(tǒng)名貴中藥材，應(yīng)用歷史悠久，主產(chǎn)于云南、廣西等省份，具有消腫定痛和活血化瘀等功效，臨床上主要用于心絞痛、冠心病等心血管系統(tǒng)疾病的防治［1］。三七的主要活性成分包括皂苷、黃酮、多糖等，其中皂苷類成分研究的最為系統(tǒng)，而其它活性成分的研究報道較少［2］。三七多糖的活性研究主要集中在免疫調(diào)節(jié)及降血糖等方面，關(guān)于三七多糖在腦缺血再灌注方面的研究未見報道［3，4］。因此，本研究通過三七多糖預(yù)處理大鼠后，建立腦缺血再灌注損傷模型，考察三七多糖對大鼠腦缺血再灌注損傷是否具有保護(hù)作用，并初步探討其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 三七多糖由本實驗室分離、純化;MDA、GSH-Px 和SOD 檢測試劑盒購自南京建成生物研究所;TNF-α、IL-1β 及IL-10 檢測試劑盒購自美國R＆D 公司;其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 模型建立、分組及給藥 雄性Wistar 大鼠，體重250～300 g，購自吉林大學(xué)實驗動物中心，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w 后，隨機分成5 組，假手術(shù)組、模型組、尼莫地平組［10 mg/(kg·d)］、三七多糖高劑量組［300 mg/(kg·d)］、三七多糖低劑量組［100 mg/(kg·d)］，每組10 只。尼莫地平及三七多糖組連續(xù)灌胃給藥15 d，每天1 次。假手術(shù)組和模型組則灌胃給予等體積生理鹽水。采用Longa 改良方法［5］，應(yīng)用頸內(nèi)動脈線栓法建立大鼠腦缺血再灌注模型。

1.3 腦組織含水量檢測 缺血2 h 再灌注24 h 后，斷頭處死大鼠，取腦。稱取腦組織濕重后，置105℃烘箱至恒重，再秤干重。用下列公示計算腦組織含水量:

腦組織含水量(%)=(腦組織濕重-腦組織干重)/腦組織濕重×100%

1.4 腦梗死面積檢測 缺血2 h 再灌注24 h后，斷頭處死大鼠，取腦。經(jīng)連續(xù)2 mm 冠狀切片及TTC(2%)溶液染色，用多聚甲醛(4%)固定。不能被TTC 染色的白色區(qū)域為梗死區(qū)，應(yīng)用美國NIH 公司的ImageJ 1.41 圖像分析軟件計算梗死面積大小。

1.5 腦組織MDA、GSH-Px、SOD、TNF-α、IL-1β和IL-10 測定 于再灌注后24 h 將各組大鼠處死，取缺血再灌注側(cè)大腦，用濾紙吸去殘血，準(zhǔn)確稱重。在冰水浴條件按下，加入4 ℃生理鹽水上(1∶ 9)，勻漿后，離心(4000 r/min，10 min)，分裝上清液于冰箱中保存?zhèn)溆?。分別采用化學(xué)比色法測定腦組織MDA 含量和GSH-Px、SOD 活性，采用ELISA 測定TNF-α、IL-1β 和IL-10 含量，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，所得結(jié)果以()表示，與模型組比較，P ＜0.05或P ＜0.01認(rèn)為具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 三七多糖對大鼠腦組織含水量及腦梗死面積比的影響 如表1 所示，假手術(shù)組大鼠腦組織含水量顯著低于模型組(P ＜0.01)，而尼莫地平和三七多糖高、低劑量組均可以明顯降低大鼠腦缺血再灌注后腦組織含水量(P ＜0.05 or P ＜0.01);同時，大鼠腦缺血再灌注后有明顯的腦梗死發(fā)生，而尼莫地平及三七多糖高、低劑量組均可以顯著降低腦組織梗死面積比(P ＜0.05)。

表1 三七多糖對大鼠腦組織含水量及腦梗死面積比的影響(，n=10)

表1 三七多糖對大鼠腦組織含水量及腦梗死面積比的影響(，n=10)

與模型組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

2.2 三七多糖對大鼠腦組織MDA 含量和GSH-Px、SOD 活性的影響 如表2 所示，與模型組比較，假手術(shù)組大鼠腦組織MDA 含量低于腦缺血再灌注模型組，而GSH-Px 和SOD 活性高于模型組(P ＜0.01)。與模型組比較，尼莫地平組及高、低劑量三七多糖組均能使缺血再灌注損傷大鼠腦組織MDA 含量降低，GSH-Px、SOD 活性升高(P ＜0.01)，且存在一定的劑量關(guān)系。

表2 三七多糖對大鼠腦組織MDA 含量和GSH-Px、SOD 活性的影響(，n=10)

表2 三七多糖對大鼠腦組織MDA 含量和GSH-Px、SOD 活性的影響(，n=10)

與模型組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

2.3 三七多糖對大鼠腦組織TNF-α、IL-1β 和IL-10 含量的影響 如圖1 所示，與模型組比較，假手術(shù)組大鼠腦組織TNF-α 和IL-1β 含量明顯降低，而IL-10 含量明顯升高(P ＜0.01)。與模型組比較，尼莫地平組及高、低劑量三七多糖組均能使缺血再灌注損傷大鼠腦組織TNF-α 和IL-1β 含量降低，升高IL-10 含量(P ＜0.01)，且存在一定的劑量關(guān)系。

3 討論

腦血管疾病是危害人類健康最重要的疾病之一，而缺血性腦血管疾病占全部腦血管疾病的60%～80%，具有發(fā)病率高、復(fù)發(fā)率高和致殘率高的特點。治療腦缺血性損傷應(yīng)盡早恢復(fù)血液再灌注，而研究發(fā)現(xiàn)，缺血后的血流恢復(fù)在特定情況下可導(dǎo)致組織損傷和功能障礙，即缺血再灌注損傷［6］。因此，預(yù)防和治療腦缺血再灌注損傷已成為防治缺血性腦血管疾病的重要環(huán)節(jié)。本研究發(fā)現(xiàn)，三七多糖預(yù)處理可以顯著減少腦缺血再灌注大鼠模型腦組織含水量及腦梗死面積(P ＜0.05 or P ＜0.01)，表明三七多糖對大鼠腦缺血再灌注損傷具有一定的保護(hù)作用。

圖1 三七多糖對大鼠腦組織TNF-α(A)和IL-1β(B)、IL-10(C)含量的影響(，n=10)

氧化應(yīng)激是導(dǎo)致腦缺血再灌注后組織損傷的重要因素之一，特別是氧自由基理論在其中占有重要地位，MDA、GSH-Px 和SOD 與氧自由基密切相關(guān)［7］。MDA 為脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，可以反應(yīng)機體受氧化應(yīng)激損害的程度［8］;GSH-Px 能夠催化過氧化氫使其分解成氧化型GSH 和水，從而減少體內(nèi)過氧化氫的含量，起到保護(hù)機體免受氧化損傷的作用［9］;而SOD 是機體內(nèi)清除氧自由基最重要的酶，廣泛存在于各種生物體內(nèi)，能清除氧自由基保護(hù)機體免受氧化損傷［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，高、低劑量的三七多糖均能使缺血再灌注損傷大鼠腦組織的MDA 含量降低，SOD 活性和GSH-Px 含量升高(P ＜0.01)。此結(jié)果表明，三七多糖具有一定的抗氧化作用，可以改善缺血再灌注大鼠腦組織氧化應(yīng)激水平，三七多糖對大鼠腦缺血再灌注損傷發(fā)揮保護(hù)作用的機制可能與其提高腦組織抗氧化能力有關(guān)。

氧化應(yīng)激可以導(dǎo)致促炎癥反應(yīng)細(xì)胞因子增加，從而使炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生，這是腦缺血再灌注損傷炎癥機制的核心調(diào)控因素之一［11］。在腦缺血再灌注損傷中，與炎癥反應(yīng)相關(guān)的因子主要有TNF-α 和IL 等。其中TNF-α 在腦缺血后誘發(fā)的組織損傷和白細(xì)胞浸潤中起重要作用，可使多核白細(xì)胞聚集并釋放炎癥介質(zhì)，阻斷TNF-α 的表達(dá)是減少缺血性神經(jīng)元損傷的有效措施［12］;IL-1β 能夠協(xié)同其他細(xì)胞因子促進(jìn)B、T 細(xì)胞活化，并且能夠誘導(dǎo)包括TNF-α在內(nèi)的炎性因子的產(chǎn)生［13］;IL-10 是一種細(xì)胞免疫反應(yīng)抑制劑，可以抑制IL-1 和TNF-α 等細(xì)胞因子生成，從而具有保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用［14］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高、低劑量的三七多糖均能夠降低缺血再灌注損傷大鼠腦組織IL-1β 和TNF-α 含量，提高IL-10 含量(P ＜0.01)。此結(jié)果表明，三七多糖對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用與抑制炎癥因子的產(chǎn)生有關(guān)。總之，通過以上研究結(jié)果表明，三七多糖對大鼠腦缺血再灌注損傷具有一定的保護(hù)作用，該保護(hù)作用與其提高腦組織抗氧化能力、抑制炎癥因子的過度產(chǎn)生有關(guān)。

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