王洪燕

(兗州市人民醫(yī)院皮膚科,山東 兗州 272000)

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Toll樣受體9和CD123在尋常型銀屑病患者皮損中的表達(dá)

王洪燕

(兗州市人民醫(yī)院皮膚科,山東 兗州 272000)

目的 探討Toll樣受體9(TLR9)和CD123在尋常型銀屑病患者皮損中的表達(dá)及意義。 方法 選擇2012年6月至2013年4月兗州市人民醫(yī)院收治的26例尋常型銀屑病患者為試驗(yàn)組，另選23例健康體檢者為對(duì)照組，分別按照常規(guī)皮膚手術(shù)采集軀干部皮損樣本進(jìn)行活檢，并采用免疫組織化學(xué)S-P法及反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)其組織中的CD123及TLR9表達(dá)情況，分析其過(guò)表達(dá)與尋常型銀屑病患者發(fā)病的機(jī)制。結(jié)果 試驗(yàn)組免疫組織化學(xué)S-P法CD123及TLR9陽(yáng)性表達(dá)率均為100%，其表達(dá)水平分別為(10.1±2.3)個(gè)/mm3和(14.4±2.0)個(gè)/mm3，而對(duì)照組表達(dá)水平分別為(1.5±0.6)個(gè)/mm3，(2.2±1.0) 個(gè)/mm3，但無(wú)陽(yáng)性表達(dá)；試驗(yàn)組RT-PCR法TLR mRNA表達(dá)水平高于對(duì)照組[(1.32±0.08) 比 (0.87±0.04)],差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論 漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞可能參與激發(fā)自身免疫T細(xì)胞活化和增殖，是尋常型銀屑病發(fā)病的一個(gè)重要機(jī)制之一。

銀屑??；Toll樣受體9；漿細(xì)胞樣樹(shù)突細(xì)胞；CD123

銀屑病是一種發(fā)生在遺傳基礎(chǔ)上細(xì)胞免疫介導(dǎo)的多種炎性因子與中性粒細(xì)胞共同參與的慢性炎癥性皮膚病[1]。Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)是免疫細(xì)胞的主要模式識(shí)別受體，在免疫反應(yīng)和慢性炎癥中起重要作用,而銀屑病患者體內(nèi)存在免疫反應(yīng)異常現(xiàn)象。漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞(plasmacytoid dendritic cells，PDCs)是近年來(lái)被認(rèn)識(shí)的一種具有特征性的樹(shù)突狀細(xì)胞的一個(gè)亞類，其在免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，也是天然的Ⅰ型干擾素(interferon,IFN)所產(chǎn)生的細(xì)胞,CD123是其表面特征標(biāo)志之一[2]。PDCs通過(guò)其表面TLR9受體產(chǎn)生Ⅰ型IFN。本研究采用免疫組織化學(xué)S-P法及反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測(cè)尋常型銀屑病患者皮損中的CD123和TLR9，旨在探討銀屑病發(fā)病、演變過(guò)程中PDCs表面CD123和TLR9所起的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2012年6月至2013年4月兗州市人民醫(yī)院收治的26例尋常型銀屑病患者為試驗(yàn)組，均符合臨床和病理學(xué)診斷，其中男14例，女12例，年齡10～43歲，平均(34.4±2.5)歲，病程1個(gè)月～25年，平均(18.5±3.2)年，患者近1個(gè)月內(nèi)均未接受治療。另選23例健康體檢者為對(duì)照組，無(wú)免疫性或系統(tǒng)性疾病，無(wú)銀屑病家族史，其中男12例，女11例，年齡13～47歲，平均(33.8±2.9)歲。兩組性別、年齡等一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),所有研究對(duì)象簽署了知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 試劑 兔抗人TLR9抗體由上海麗臣生物科技有限公司提供，鼠抗人CD123抗體由廣州長(zhǎng)瑞生物有限公司提供，生物素標(biāo)記的二抗、3,3′-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽顯色劑均為上海江萊生物科技有限公司提供，過(guò)氧化氫(H2O2)、枸櫞酸緩沖液由廣州市博翱中誠(chéng)化工科技有限公司提供。

1.2.2 標(biāo)本采集 兩組受試者按照常規(guī)皮膚手術(shù)采集軀干部皮損樣本進(jìn)行活檢，每位受試者取一塊皮損樣本，均分為兩份，一份常規(guī)石蠟組織包埋，免疫組織化學(xué)備用，一份冷凍-70 ℃ 保存，RT-PCR，冰凍切片免疫組織化學(xué)備用。

1.2.3 免疫組織化學(xué)S-P法 石蠟組織包埋標(biāo)本4 μm連續(xù)切片，脫蠟至水，3% H2O2去離子水氧化，枸櫞酸溶液抗原修復(fù)，免疫組織化學(xué)染色；冷凍標(biāo)本4～6 μm冰凍切片，冷丙酮(二甲基酮)固定，免疫組織化學(xué)染色。正常羊血清封閉，室溫孵育。滴加TLR9抗體，平衡鹽溶液沖洗，滴加二抗，PBS沖洗。3,3′-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽顯色，水洗，蘇木素復(fù)染，封片。陰性對(duì)照用磷酸鹽緩沖液代替一抗。

1.2.4 RT-PCR 稱取50 mg皮損樣本用Trizol法常規(guī)提取RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)體系為25 μL：dNTPmix(10 mmol/L)1 μL，MgCl2(25 mmol/L)1.5 μL，PCR緩沖液2.5 μL，cDNA模板、1 mmol/L上游及下游引物各2 μL，余下用雙蒸水補(bǔ)足25 μL。擴(kuò)增條件：預(yù)變性95 ℃ 15 min，變性95 ℃ 40 s，退火58 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，共32個(gè)循環(huán)。采用南京金斯瑞生物科技有限公司合成的引物序列：β-肌動(dòng)蛋白為參照物，上游引物、下游引物、預(yù)擴(kuò)增片斷分別為5′-GTGGGGCGCGCCCAGGCACCA-3′、5′-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3′、 538 bp；TLR9上游引物、下游引物、預(yù)擴(kuò)增片斷分別為5′-TGGTGCAGGAGCCAAGAC-3′、 5′-GAAGGGACATCGACGACAGG-3′、415 bp。

1.2.5 結(jié)果判定 免疫組織化學(xué)染色以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜有棕黃色染色為陽(yáng)性，用顯微鏡10×40下觀察，隨機(jī)選4個(gè)視野，計(jì)算平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/mm3(個(gè)/mm3)。RT-PCR用HPIAS-1000軟件對(duì)電泳條帶分析，計(jì)算TLR9/β-肌動(dòng)蛋白的值，作為T(mén)LR9的相對(duì)水平。

2 結(jié) 果

2.1 兩組受試者免疫組織化學(xué)結(jié)果 試驗(yàn)組患者皮損中CD123、TLR9陽(yáng)性表達(dá)率均為100%，對(duì)照組均為0%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；試驗(yàn)組患者皮損中CD123、TLR9陽(yáng)性表達(dá)水平均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表1。

表1 兩組受試者皮損中CD123及TLR9陽(yáng)性表達(dá)情況 個(gè)/mm3)

TLR9：Toll樣受體9;試驗(yàn)組：尋常型銀屑病患者；對(duì)照組：健康體檢者

2.2 兩組受試者RT-PCR測(cè)定結(jié)果 試驗(yàn)組患者TLR9 mRNA相對(duì)水平高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(1.32±0.08)比(0.87±0.04)](t=24.390,P<0.01)，見(jiàn)圖1。

M:標(biāo)準(zhǔn)參照； 1、2：正常對(duì)照； 3、4：尋常型銀屑病皮損

圖1 Toll樣受體9(TLR9)mRNA 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物電泳圖

3 討 論

近年來(lái)，銀屑病患者體內(nèi)存在天然免疫異常現(xiàn)象已被大量研究所證實(shí)。TLR是一種天然免疫受體，已發(fā)現(xiàn)人體有11種 TLRs，主要分布于免疫細(xì)胞，如PDCs、淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等，主要介導(dǎo)急性炎癥反應(yīng)，釋放大量致炎因子，如白細(xì)胞介素(interluekin,IL)-1、IL-6、IL-12等，同時(shí)輔助建立以Th1型免疫應(yīng)答為主的抗原特異性獲得性免疫應(yīng)答[3]。PDCs有極強(qiáng)的分泌IFN(IFN-α/β)的能力，這種能力在一些內(nèi)源性配體和病原體相關(guān)分子模式反應(yīng)中是其他細(xì)胞的1000倍[4]，故被認(rèn)為是天然的Ⅰ型IFN產(chǎn)生細(xì)胞。PDCs可同時(shí)分泌高水平的Ⅰ型IFN和IL-12。Ⅰ型IFN可上調(diào)所有T細(xì)胞亞類上的IL-12受體,因此被認(rèn)為是兩種受體共同激發(fā)Th1反應(yīng)機(jī)制。髓樣樹(shù)突狀細(xì)胞由單核細(xì)胞分化產(chǎn)生，在微生物刺激下并不能同時(shí)分泌Ⅰ型IFN和IL-12,僅能分泌IL-12。一些自身免疫性疾病(如紅斑狼瘡、干燥綜合征、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等)的炎癥組織中均存在PDCs的浸潤(rùn)。本研究銀屑病患者皮損中有PDCs的表面特征識(shí)別標(biāo)記CD123及TLR9受體表達(dá)，而正常人沒(méi)有，證實(shí)了PDCs存在于銀屑病患者皮膚炎癥組織中，提示其表達(dá)具有較高的特異性，可能參與了銀屑病的免疫應(yīng)答，可能是其發(fā)病的機(jī)制之一。

人體中，TLR9主要表達(dá)于PDCs，不表達(dá)于髓樣樹(shù)突狀細(xì)胞。PDCs依賴于其表面TLR9受體分泌Ⅰ型IFN和IL-12。周郅軻等[5]報(bào)道，TLR9及其mRNA在與感染有關(guān)的銀屑病皮損中高表達(dá)。本研究中，試驗(yàn)組銀屑病患者皮損中存在TLR9及其mRNA高表達(dá)，而對(duì)照組TLR9無(wú)表達(dá)，低表達(dá)其mRNA，提示銀屑病皮損中TLR9轉(zhuǎn)錄活躍，可能高表達(dá)其基因產(chǎn)物。TLR9主要識(shí)別細(xì)菌DNA中非甲基化CpG基序(CpG DNA)，通過(guò)蛋白髓樣分化因子88的信號(hào)傳遞，在機(jī)體中參與免疫應(yīng)答[6]。研究證實(shí)，T細(xì)胞自身反應(yīng)通過(guò)TLR介導(dǎo)外周靶器官炎癥,誘發(fā)明顯的自身免疫性疾病[7]。銀屑病發(fā)病與病毒感染有關(guān)，病毒通過(guò)表達(dá)于PDCs的TLR9誘導(dǎo)Ⅰ型 IFN和IL-12的分泌。病毒成分與TLR9結(jié)合而活化，經(jīng)蛋白髓樣分化因子88信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，激活核因子κB、干擾素調(diào)節(jié)因子7等轉(zhuǎn)錄因子和蛋白激酶，釋放IL-6、IL-8、IL-12等炎性介質(zhì)和Ⅰ型IFN，介導(dǎo)急性炎癥反應(yīng)，誘發(fā)Thl型細(xì)胞免疫應(yīng)答[8]。這反映了PDCs的TLR9在銀屑病發(fā)病過(guò)程的抗感染防御反應(yīng)中起重要作用。

綜上所述，銀屑病皮損高表達(dá)CD123、TLR9及其mRNA,證實(shí)PDCs出現(xiàn)在銀屑病患者皮損中，因此認(rèn)為其可能參與激發(fā)自身免疫T細(xì)胞活化和增殖，導(dǎo)致銀屑病發(fā)病的一個(gè)天然免疫途徑，但有待進(jìn)一步的論證。若能進(jìn)一步了解PDCs的功能以及其與T細(xì)胞、其他免疫細(xì)胞的相互作用，將為銀屑病的免疫反應(yīng)及病理生理研究拓展新的思路。

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Expression of Toll-like Receptors 9 and CD123Plasmacytoid Dendritic Cells in Lesions of Patients with Psoriasis Vulgaris

WANGHong-yan.

(DepartmentofDermatology,People′sHospitalofYanzhouCity,Yanzhou272000,China)

Objective To investigate the expression of toll-like receptors 9(TLR9) and CD123plasmacytoid dendritic cells in skin lesions of patients with psoriasis vulgaris and its significance.Methods A total of 26 patients with psoriasis vulgaris admitted in People′s hospital of Yanzhou City from Jun.2012 to Apr.2013 were selected as the experimental group，another 23 healthy people underwent physical examination were selected as the control group.Skin lesion samples from the bodies of all the cases were collected by the method of general skin surgeries and received biopsies,and the expression of CD123and TLR9 in the samples were detected by S-P immunohistochemical method and reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR),and the relationship between the overexpression of the two factors and the pathogenesis of psoriasis vulgaris was analyzed.Results The positive expression rate of CD123and TLR9 in the experiment group detected by S-P immunohistochemical method were both 100%,the expression mean values of CD123and TLR9 were respectively (10.1±2.3) figures/mm3，(14.4±2.0)figures/mm3，while in control group，the expression mean values of CD123and TLR9 were respectively (1.5±0.6) figures/mm3，(2.2±1.0) figures/mm3，both without positive expression;the expression levels of TLR mRNA in experiment group and control group detected by RT-PCR method were (1.32±0.08) figures/mm3and (0.87±0.04) figures/mm3，respectively，the difference was statistically significant(P<0.01).Conclusion Plasmacytoid dendritic cells may be involved in stimulating the activation and proliferation of autoimmune T cell,which is an important mechanism of the incidence of psoriasis vulgaris.

Psoriasis; Toll like receptor 9; Plasmacytoid dendritic cells; CD123

R758.63

A

1006-2084(2015)12-2249-03

10.3969/j.issn.1006-2084.2015.12.052

2014-03-23

2014-09-23 編輯:伊姍