龐心怡 ，滿朝新，趙玥明，周文琦，閆天文，柴云雷，韓建春，姜毓君，

(1東北農(nóng)業(yè)大學食品學院/乳品科學教育部重點實驗室，哈爾濱 150030;2 東北農(nóng)業(yè)大學國家乳業(yè)工程技術(shù)研究中心，哈爾濱 150086)

沙門氏菌(Salmonella)在環(huán)境中廣泛存在，是一種引起食源性疾病的重要致病菌，能引起人胃腸炎、傷寒、敗血癥等癥狀［1］。最近的一項美國食源性疾病暴發(fā)的報告中指出，沙門氏菌是最常見的細菌性病原體，占所有細菌性食物中毒的52%［2］。近年來在我國，沙門氏菌也是微生物引起食源性疾病中最主要的病原菌之一，占17.19%［3］。沙門氏菌菌屬類型多樣，抗原復雜，目前已分離出2 500 多個血清型。許多動物性食品都是沙門氏菌污染的主要來源，其中肉類更為常見［4］。目前檢測沙門氏菌的傳統(tǒng)方法費時費力，PCR 為代表的分子生物學方法需要昂貴儀器和復雜設(shè)備，不能達到現(xiàn)代檢測對于高效、簡便、低成本的要求［5］。近年來，環(huán)介導等溫擴增法(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)以其快速、高效、靈敏和恒溫擴增的特點，成為受到關(guān)注的核酸擴增的新技術(shù)之一。LAMP 技術(shù)利用具有鏈置換活性的Bst DNA 聚合酶，通過對靶基因的6 個區(qū)段設(shè)計的4 條特異性的引物，在恒溫(60～65℃)、短時間(1h)條件下達到對目的基因的高效擴增［6］。由于LAMP 的擴增產(chǎn)物是靶基因的一系列反向重復形成的類似花椰菜結(jié)構(gòu)，電泳呈現(xiàn)的是不同片段大小組成的階梯式圖譜，也可以根據(jù)生成的焦磷酸鎂沉淀通過肉眼來判斷反應(yīng)是否發(fā)生［7］。本研究擬利用環(huán)介導等溫擴增技術(shù)檢測肉中的沙門氏菌，并與傳統(tǒng)PCR 方法比較，驗證其靈敏度和特異性，為這一方法的推廣提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

細菌基因組、DNA 提取試劑盒，北京天根生物技術(shù)有限公司;Bst 大片段DNA 聚合酶New England Biolabl;dNTP，購自于Promega 公司;甜菜堿 (Betaine)，美國Sigma 公司;DNA marker，北京百泰克生物技術(shù)有限公司;瓊脂糖，西班牙Biowest 公司;溴化乙錠(EB)，購自于美國sigma 公司。Tc-25/H 型基因擴增儀，美國PCR Kin Elmer Gene Amp;UVP 凝膠成像儀，美國UVP 公司;DYY-10C 型電泳儀，北京市六一儀器廠。實驗所用菌株見表1。

1.2 實驗方法

1.2.1 細菌的培養(yǎng)以及DNA 模板的提取 取沙門氏菌ATCC14028 作為標準菌株，在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中活化3 株沙門氏菌參考菌株及其他8 株非沙門氏菌菌株，在37℃條件下培養(yǎng)過夜。應(yīng)用細菌基因組提取試劑盒提取處于對數(shù)生長期的細菌DNA，將得到的DNA 模板于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 LAMP 引物設(shè)計與合成 在GenBank 中查找到的決定沙門氏菌侵襲力的腸侵襲蛋白，同時也是高度保守的屬特異性基因invA 設(shè)計特異性的LAMP 引物［8］。應(yīng)用Primer Explorer 4.0 引物設(shè)計軟件，得到的一套特異性引物，引物序列:FIP-CCCAGATCCCCGCATTGTTGAT

表1 實驗所用菌株

TTTTCCGCCCCATATTAT C-GCTAT，BIP-GACCATCACCAATGGTCAGCATTTTATTGGCGGTATTTCGGTGGG，F(xiàn)3 -GTTCAACAGCTGCGTCATGA，B3-CGCTATTGCCGGCATCATTA。引物由上海英俊公司合成。

1.2.3 LAMP 反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化 25μL 的LAMP 反應(yīng)體系包括:2 個內(nèi)引物FIP 和BIP、2 個外引物F3 和B3、脫氧核糖核苷酸(dNTPs)、Mgcl2、甜菜堿、10 × Buffer、DNA 模板，滅菌水補足體系。將混合物在95℃加熱5min 后立即冷卻，再加入Bst DNA聚合酶1μL，在65℃恒溫60min，隨即進行酶的滅活，加熱到80℃持續(xù)2min 終止反應(yīng)。選擇對LAMP 體系中的關(guān)鍵因素進行優(yōu)化，包括外引物與內(nèi)引物濃度比(1∶4、1∶6、1∶8、1∶10)、鎂離子濃度(0、1、2、3、4、5、6mmol/L)、dNTP 濃度(0.4、0.8、1.2、1.6、2、2.4mmol/L)、甜菜堿濃度 (0、0.4、0.6、0.8mmol/μL)，根據(jù)LAMP 擴增后電泳圖條帶的有無和亮度選擇最適條件，建立LAMP 反應(yīng)體系。

1.2.4 LAMP 檢測沙門氏菌的靈敏度 取1mL 處于對數(shù)生長期的沙門氏菌純培養(yǎng)液，用0.85%生理鹽水進行10 倍梯度稀釋100～109倍，并采用稀釋平板法計算出初始菌液濃度為9.8 ×108CFU/mL。用試劑盒對每個稀釋度的沙門菌液提取基因組DNA，并用各個稀釋度的DNA 作為模板分別進行LAMP 和PCR 反應(yīng)。取5μL 擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，在110V 電壓下電泳40min，并利用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.2.5 LAMP 檢測沙門氏菌的特異性 按照1.2.1 步驟，提取沙門氏菌以及其他8 株非沙門氏菌的DNA，并作為LAMP 反應(yīng)的模板，進行LAMP 反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物進行電泳驗證。

1.2.6 LAMP 檢測人工污染肉中沙門氏菌 鮮豬肉，購自當?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場，人工染菌前經(jīng)國標法確認不含有沙門氏菌。按照GB/T4789.4-2008，取25g 豬肉樣品放入盛有并225mL BPW 的無菌均質(zhì)袋中，制成1∶10 稀釋液。添加108～100CFU/mL 不同稀釋度的沙門氏菌純菌液2.5mL分別與于9 組25mL 稀釋液中，均質(zhì)后沙門氏菌濃度即為107～10－1CFU/mL，分別用試劑盒提取每一組人工污染肉漿中沙門氏菌的DNA，進行LAMP 反應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 LAMP 反應(yīng)體系的建立

通過優(yōu)化，確立的最終LAMP 反應(yīng)體系為:1.6μmol/L 的FIP 和BIP，0.2μmol/L 的F3 和B3，1.6 mmol/L dNTPs，6mmol/L MgCl2，1μL 的Bst DNA 聚合酶(8U)，1mol/L 甜菜堿，2.5μL 10 × Buffer 及2μL模板。對沙門氏菌標準菌株ATCC14028 采用優(yōu)化的LAMP 體系進行擴增，電泳后如圖1，呈現(xiàn)LAMP 特有的階梯狀條帶，空白則未出現(xiàn)條帶。

圖1 沙門氏菌LAMP 檢測結(jié)果

2.2 LAMP 檢測沙門氏菌純培養(yǎng)物的靈敏度

從圖2 可見，沙門氏菌純培養(yǎng)物在稀釋到109倍時沒有條帶產(chǎn)生，本實驗建立的LAMP 方法對沙門氏菌純培養(yǎng)物的檢出限為9.8×100CFU/mL。對比圖3 可知，PCR法檢測沙門氏菌的靈敏度是9.8×102CFU/mL，因此，本實驗建立的LAMP 法的檢出限是PCR 的100 倍。

圖2 LAMP 檢測沙門氏菌純菌靈敏度電泳圖

圖3 PCR 檢測沙門氏菌純菌的靈敏度電泳圖

2.3 LAMP 檢測沙門氏菌的特異性

如圖4 所示，4 株沙門氏菌的泳道均有LAMP 特異性的條帶產(chǎn)生。其他8 株非沙門氏菌均呈陰性反應(yīng)，沒有出現(xiàn)特異性的階梯形條帶。

2.4 LAMP 檢測人工污染肉漿中沙門氏菌的靈敏度

按照1.2.6 所示，人工污染肉漿中沙門氏菌的濃度為9.8×107～9.8×10－1CFU/mL。LAMP 檢測人工污染肉中沙門氏菌的檢出限為9.8×101CFU/mL (圖5)。

3 討論

圖4 LAMP 特異性電泳圖

圖5 LAMP 檢測人工污染肉中沙門氏菌的靈敏度電泳圖

目前，分子生物學的發(fā)展帶動了各種基于核酸擴增的方法在檢測致病菌方面的發(fā)展。沙門氏菌的分子生物學檢測方法主要包括PCR 以及熒光定量PCR，但是復雜昂貴的儀器和對檢測人員較高的技術(shù)要求使得這一技術(shù)不適合在基層推廣使用和現(xiàn)場的快速檢測［9］。本實驗建立的檢測肉中沙門氏菌的LAMP 方法快速簡便，無需復雜的熱循環(huán)儀，普通的水浴鍋就可以滿足溫度的要求［10］。由于LAMP 的引物是針對靶基因的6 個區(qū)段設(shè)計的，因此特異性很強［11］。無論是沙門氏菌的純培養(yǎng)物還是人工污染的肉樣，本實驗建立的LAMP 方法靈敏度都可以達到普通PCR 的100 倍，從而具有較高的靈敏度。從反應(yīng)時間來看，LAMP 從模板制備到結(jié)果判斷只需要2.5h 左右的時間。即使包括樣品12h 的增菌時間，LAMP 只需15h 就可以得出最終結(jié)果，而傳統(tǒng)方法對陰性樣品的確定最短也需要4d［9］。實際樣品的LAMP 檢測之前的增菌過程是十分必要的，可以減少來自樣品中死菌DNA 的影響，相應(yīng)也可以提高沙門氏菌的檢出率［14］。有報道指出LAMP相比較于PCR，不易受食品基質(zhì)中成分的抑制作用，對DNA 模板純度要求不高［12］。

盡管LAMP 具有以上眾多的優(yōu)點，其自身的局限性和缺點也是無法避免的。靈敏度高和特異性強的引物對于LAMP 試驗起到至關(guān)重要的作用，LAMP 需要設(shè)計4 條甚至6 條引物，需要考慮許多復雜因素，難度較大［15］。此外，LAMP 靈敏度高的優(yōu)點也會導致易產(chǎn)生假陽性污染的缺陷，在實際操作過程中，要注意分區(qū)操作，防治污染。

總之，快速、靈敏、簡便、高效的LAMP 方法為致病菌的檢測，特別是基層實驗室快速初篩沙門氏菌，提供了一個新的思路［16］?；贚AMP 技術(shù)開發(fā)的致病菌檢測試劑盒也已成功應(yīng)用于食品檢測，這表明LAMP 技術(shù)具有良好的發(fā)展前景，有望得到更為廣泛的應(yīng)用［17］。

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