吳 燕，周 敏，張福成（解放軍空軍總醫(yī)院，北京 100142）

抗血小板治療在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病治療中起著十分重要的作用。鹽酸替羅非班是一種非肽類的血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受體（該受體是與血小板聚集過程有關(guān)的主要血小板表面受體）的可逆性拮抗藥，可阻止纖維蛋白原與糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受體結(jié)合，從而阻斷血小板的交聯(lián)及血小板的聚集[1-3]。鹽酸替羅非班可抑制二磷酸腺甘誘導(dǎo)的血小板聚集及延長出血時間，可強效抑制血小板功能，作用顯著，特異性強。目前，關(guān)于鹽酸替羅非班原料藥和注射劑的質(zhì)量標準未見文獻報道。為此，本研究建立了以高效液相色譜（HPLC）法測定鹽酸替羅非班原料藥的含量及有關(guān)物質(zhì)的方法。

1 材料

LC-10AD HPLC儀，包括SPD-10AVP檢測器、CLASSLC 10A色譜工作站（日本島津公司）；AE-240萬分之一電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

鹽酸替羅非班對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100646-200401，純度：99.9%）；鹽酸替羅非班原料藥（解放軍空軍總醫(yī)院自制，批號：201230601、201230602、201230603，質(zhì)量分數(shù)：99.5%、99.6%、99.7%）；鹽酸替羅非班中間體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（解放軍空軍總醫(yī)院自制，批號均為：201230601，純度分別為：99.4%、99.5%、99.4%）；甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑為分析純，水為屈臣氏水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：CAPCELL PAK C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：流動相A為0.1%醋酸銨溶液（pH 2.30）-乙腈-甲醇（90 ∶5∶5，V/V/V），流動相B為0.1%醋酸銨溶液（pH 2.30）-乙腈-甲醇（10 ∶85 ∶5，V/V/V），梯度洗脫程序見表1；檢測波長：227 nm；柱溫：35 ℃；流速：1.0 ml/min；進樣量：10μl。

2.2 含量測定方法

取樣品（批號：201230601）適量，用流動相B定量稀釋制成0.1 mg/ml的溶液，作為供試品溶液，精密量取10μl進樣測定；另取鹽酸替羅非班對照品適量，同法制備對照品溶液，進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。按外標法以峰面積計算含量。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution program

圖1 高效液相色譜圖A.對照品溶液；B.供試品溶液；1.鹽酸替羅非班Fig 1 HPLC chromatogramsA.substance control；B.test sample；1.tirofiban hydrochloride

2.3 有關(guān)物質(zhì)測定方法

取樣品（批號：201230601）適量，加流動相B稀釋制成1 mg/ml的溶液，作為供試品溶液；精密量取1 ml，置于100 ml量瓶中，加流動相B稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液。取對照溶液10 μl注入HPLC儀，調(diào)節(jié)檢測靈敏度，使主成分色譜峰高約為滿量程的20%；再精密量取供試品溶液與對照溶液各10 μl，分別注入HPLC儀，記錄色譜，詳見圖2。供試品溶液的色譜圖中如有雜質(zhì)峰，按自身對照法計算有關(guān)物質(zhì)的量。

圖2 有關(guān)物質(zhì)測定和系統(tǒng)適用性試驗高效液相色譜圖A.空白溶劑（水）；B.系統(tǒng)適用性溶液；C.供試品溶液；D.對照溶液；1.中間體Ⅰ；2.中間體Ⅲ；3.中間體Ⅱ；4.鹽酸替羅非班Fig 2 HPLC chromatograms of related substance and system suitabilityA.blank solvent（water）；B.system suitability solution；C.test sample；D.substance control；1.intermediateⅠ；2.intermediate Ⅲ；3.intermediateⅡ；4.tirofiban hydrochloride

2.4 系統(tǒng)適用性試驗

分別稱取鹽酸替羅非班中間體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各10 mg，置于10 ml量瓶中，用流動相B定容，得系統(tǒng)適用性貯備液；精密稱取樣品（批號：201230601）100 mg，置于100 ml量瓶中，精密移取系統(tǒng)適用性貯備液1 ml置于此量瓶中，定容，搖勻，得系統(tǒng)適用性溶液。量取系統(tǒng)適用性溶液10 μl注入HPLC儀，記錄色譜，詳見圖2。結(jié)果表明，在“2.1”項色譜條件下，鹽酸替羅非班與各中間體及各個中間體之間的分離度均＞1.5，分離度良好。

2.5 方法專屬性考察

取樣品（批號：201230601）約25 mg，精密稱定，共5份，分別置于25 ml量瓶中：1份加入2 mol/L鹽酸溶液1 ml，放置1 h；1份加入30%過氧化氫溶液1 ml，放置2 h；1份加入流動相1 ml使溶解，在強光4 500 lx下照射4 h；1份加入流動相1 ml使溶解，并在100 ℃水浴中加熱2 h；1份加入2 mol/L氫氧化鈉溶液1 ml，放置1 h。上述5份溶液分別用流動相B稀釋至刻度，搖勻，各量取10 μl，分別注入HPLC儀，記錄色譜，詳見圖3。結(jié)果表明，樣品在酸、堿、氧化、高溫和光照條件下均保持相對穩(wěn)定，各破壞條件下產(chǎn)生的降解產(chǎn)物峰與主峰均能達到基線分離，且各雜質(zhì)間的分離度良好。

圖3 專屬性試驗高效液相色譜圖A.酸破壞樣品；B.堿破壞樣品；C.氧化破壞樣品；D.高溫破壞樣品；E.光照破壞樣品；F.未破壞樣品；1.鹽酸替羅非班Fig 3 HPLC chromatograms of specificity testA.sample destroyed by acid；B.sample destroyed by alkali；C.sample destroyed by oxidation；D.sample destroyed by high temperature；E.sample destroyed by illumination sample；F.undestroyed sample；1.tirofiban hydrochloride；

2.6 線性關(guān)系考察

取鹽酸替羅非班對照品適量，精密稱定，加流動相B溶解并稀釋制成每1 ml中約含1 000 μg的線性貯備液；分別取鹽酸替羅非班中間體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ適量，精密稱定，分別加流動相B溶解并稀釋制成每1 ml中各約含100 μg的線性貯備液。分別精密量取上述各線性貯備液適量，用流動相B按逐級稀釋的方法制成系列濃度溶液，測定峰面積，以峰面積（y）對質(zhì)量濃度（x，μg/ml）進行線性回歸，回歸方程和線性范圍見表2。

2.7 檢測限和定量限

分別取“2.6”項下鹽酸替羅非班中間體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ線性貯備液適量，均采用逐步稀釋法稀釋至0.05 μg/ml，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，以信噪比3計算得3個中間體的最低檢測限均為0.5 ng；以信噪比10計算得3個中間體的定量限均為2.0 ng。

表2 鹽酸替羅非班及其中間體的回歸方程和線性范圍Tab 2 The regression equation and linear range of tirofiban hydrochloride and intermediates

2.8 精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗

取“2.2”項下的鹽酸替羅非班對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件重復(fù)進樣6次，記錄色譜，結(jié)果鹽酸替羅非班峰面積的RSD為0.35%，表明儀器精密度良好。取樣品（批號：201230601）適量，平行6份，按“2.2”項下方法處理制備含量測定供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，得平均含量為99.8%，鹽酸替羅非班峰面積的RSD為0.19%，表明本方法重復(fù)性良好。取“2.2”項下含量測定供試品溶液（批號：201230601）適量，平行6份，分別在室溫下放置0、2、4、8、12、24 h后進樣測定，計算得到鹽酸替羅非班峰面積的RSD為0.33%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 回收率試驗

取鹽酸替羅非班對照品約8、10、12 mg，各3份，精密稱定，分別置于100 ml量瓶中，加流動相B使其溶解，定容，搖勻，進樣測定，記錄色譜，計算回收率，結(jié)果詳見表3。

表3 回收率試驗結(jié)果（n＝3）Tab 3 Results of recovery test（n＝3）

2.10 樣品測定

取對照品和3批樣品適量，按“2.2”項下方法處理并按“2.1”項下色譜條件進樣測定，計算含量；取3批樣品適量，按“2.3”項下方法處理并進樣測定，計算有關(guān)物質(zhì)的量（各單個雜質(zhì)均不得過0.2%，總雜質(zhì)不得過0.6%），結(jié)果見表4。

3 討論

表4 樣品測定結(jié)果（n＝3）Tab 4 Results of sample determination（n＝3）

3.1 流動相的選擇[4-5]

本試驗在篩選流動相過程中，曾設(shè)計了多組不同組成的流動相體系（磷酸鹽-乙腈，辛烷/磷酸鹽-乙腈，醋酸鹽-甲醇，醋酸鹽-甲醇/乙腈等），通過對每個組成的流動相體系進行考察，發(fā)現(xiàn)醋酸銨-甲醇/乙腈體系按本試驗比例混合后能滿足分析要求。同時，緩沖液的pH對峰形和分離度也有較大的影響：隨著pH的降低，鹽酸替羅非班與各中間體及雜質(zhì)的分離度增加，且峰形較尖銳。但考慮到色譜柱的耐酸性及使用壽命，最終確定流動相pH為2.30。

3.2 梯度洗脫程序的確定[6-7]

鹽酸替羅非班與其3個中間體結(jié)構(gòu)較相似，出峰時間較接近，因此選擇合適的梯度洗脫方式才能達到分離度要求。中間體Ⅰ與中間體Ⅲ相鄰較近，難以分開，故將此處的梯度變緩；而鹽酸替羅非班與中間體Ⅱ之間沒有其他雜質(zhì)，故調(diào)節(jié)此處梯度變化，使中間體Ⅱ快速出峰，以節(jié)省洗脫時間。通過對梯度的調(diào)整，在表1所示梯度洗脫程序下，主成分與各中間體、雜質(zhì)均能達到有效分離，且各峰純度都達100%。故選擇此梯度洗脫程序進行洗脫。

3.3 色譜柱的選擇[8-10]

在選定流動相系統(tǒng)下，對CAPCELL柱、Thermo和Varian鍵合相柱進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用Thermo鍵合相柱分析時，中間體Ⅰ與中間體Ⅲ不能實現(xiàn)良好分離；而采用Varian鍵合相柱分析時峰形較差，且流動相的pH接近其耐酸值極限。故最終采用CAPCELL PAK C18為本研究的色譜柱。

綜上所述，該方法簡便、準確、專屬性強、靈敏度高，適用于鹽酸替羅非班原料藥的含量及有關(guān)物質(zhì)測定。

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