楊小軍，丁永輝（1.西北民族大學(xué)化工學(xué)院，蘭州 73014；.甘肅省食品藥品監(jiān)督管理局，蘭州 730070）

藏藥綠蘿花Scindapsus aureus（Linden ex Andre）Engl.為天南星科綠蘿屬黃葉綠蘿（別名：黃金葛）的干燥花及花蕾，是青藏高原寒冷地帶特有的植物藥材；其性微寒，具有濃烈的香氣。眾多研究表明，藏藥綠蘿花中的黃酮類物質(zhì)是其主要藥用成分，具有較多的藥理活性作用，如抑菌、抗病毒、抗氧化、防衰老等，對(duì)高血壓、高血脂和冠心病等有明顯的治療作用[1-3]。因此，藏藥綠蘿花作為一種藥用資源，對(duì)其進(jìn)行研究是很有必要的。

藏藥綠蘿花黃酮類物質(zhì)的研究發(fā)展至今，報(bào)道了許多有效的提取方法[2-4]。超聲波輔助提取技術(shù)也是其中一種，由于其具有操作簡(jiǎn)便、節(jié)能、省時(shí)等特點(diǎn)而被廣泛用于天然藥物的浸提。傳統(tǒng)的工藝設(shè)計(jì)方法，如正交設(shè)計(jì)、均勻設(shè)計(jì)等，都有各自的局限性，不能全面地優(yōu)化工藝。響應(yīng)面分析法采用多元二次回歸方法作為函數(shù)估計(jì)的工具，研究因子與響應(yīng)面之間、因子與因子之間的相互關(guān)系，該方法試驗(yàn)次數(shù)少、周期短、得到的回歸方程精度高、可研究幾種因素間的交互作用，是一種具有突出優(yōu)勢(shì)的優(yōu)化試驗(yàn)條件的數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法[5-9]。

本研究探討超聲輔助提取藏藥綠蘿花中總黃酮成分，在查閱相關(guān)文獻(xiàn)[1-8]和預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇超聲提取時(shí)間、溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比和功率作為考查因素，采用Box-Behnken 中心組合設(shè)計(jì)及響應(yīng)面法對(duì)綠蘿花總黃酮超聲波提取條件進(jìn)行全面優(yōu)化，為提高綠蘿花中總黃酮的提取率和更好地開(kāi)發(fā)以綠蘿花黃酮為主的藥物及功能食品提供合理的依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

SPECORD50 型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；SK82002H 型超聲波儀（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）；AHK-04A 型手提式粉碎機(jī)（廣州市旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司）；B204-S 型萬(wàn)分之一電子天平（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；DHG-9075A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司）。

1.2 藥材

綠蘿花產(chǎn)自西藏自治區(qū)，購(gòu)于西藏眾友大藥房（批號(hào)：130244），經(jīng)蘭州大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室馬志剛教授鑒定為天南星科綠蘿屬黃葉綠蘿Scindapsus aureus的干燥花及花蕾。

1.3 藥品與試劑

蘆丁對(duì)照品（美國(guó)Sigma 公司，批號(hào)：120715-201216，供含量測(cè)定用，純度：99.22%）；無(wú)水乙醇、甲醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉（天津市百世化工有限公司），以上試劑均為分析純；蒸餾水（試驗(yàn)時(shí)自制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃酮提取率的測(cè)定

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 準(zhǔn)確稱取干燥至恒質(zhì)量的蘆丁對(duì)照品20.00 mg，置于100 ml 量瓶中，加少量甲醇，微微加熱至溶解，放置冷卻后再加無(wú)水甲醇稀釋至刻度，搖勻即得。

2.1.2 供試品溶液的制備 將綠蘿花用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)3號(hào)藥篩，準(zhǔn)確稱取3.00 g放入錐形瓶?jī)?nèi)，用無(wú)水乙醇浸泡12 h后，進(jìn)行超聲提取。提取結(jié)束后進(jìn)行減壓抽濾，所得濾液轉(zhuǎn)移至100 ml量瓶?jī)?nèi)，用無(wú)水乙醇定容至刻度，即得。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及方法學(xué)考察[4]分別量取對(duì)照品溶液0、0.5、1.0、2.0、2.5 ml，分別置于25 ml 量瓶中，各先加入70%乙醇使其體積為8 ml，然后再各加入50 g/L的亞硝酸鈉溶液1.0 ml，搖勻，反應(yīng)6 min后再加入100 g/L的硝酸鋁溶液1.0 ml，搖勻，靜置5 min；各加入10.0 ml 氫氧化鈉溶液（40 g/L），最后用70%乙醇定容，靜置15 min。以不含蘆丁對(duì)照品的溶液作空白，在400～600 nm波長(zhǎng)范圍掃描蘆丁對(duì)照品溶液吸收光譜，確定最大吸收波長(zhǎng)為510 nm；再在最大波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，以對(duì)照品的質(zhì)量濃度（c）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為A＝0.083 0c+0.088 3（r＝0.999 7）。結(jié)果表明，蘆丁檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為4～20 μg/ml。根據(jù)相關(guān)要求進(jìn)行方法學(xué)考察，結(jié)果精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和回收率試驗(yàn)均符合要求。

2.1.4 總黃酮提取率的測(cè)定 準(zhǔn)確量取樣品溶液1.0 ml，按“2.1.3”項(xiàng)下方法操作，計(jì)算總黃酮質(zhì)量濃度，再按下式計(jì)算總黃酮提取率：總黃酮提取率（%）＝樣品溶液中總黃酮的質(zhì)量（g）/原料質(zhì)量（100 g）。

2.2 單因素試驗(yàn)

在查閱相關(guān)文獻(xiàn)[1-8]和預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇超聲提取時(shí)間、溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比和功率為試驗(yàn)因素。

2.2.1 超聲提取時(shí)間的選擇 精確稱取5 份粉碎的藏藥綠蘿花各3.0 g，置于100 ml 錐形瓶中，固定80%乙醇為提取溶劑、溫度為45 ℃、液料比為12 ∶1、功率為300 W，考察提取時(shí)間分別為10、20、30、40、50 min時(shí)黃酮提取率的變化。提取時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響見(jiàn)圖1A。

由圖1A可知，起初總黃酮提取率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)而升高；提取時(shí)間達(dá)到30 min 時(shí)，總黃酮提取率達(dá)到最高；之后總黃酮提取率略有下降。分析其原因可能是由于提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，超聲波對(duì)黃酮的結(jié)構(gòu)有所破壞，以致總黃酮提取率下降，因此選擇提取時(shí)間為30 min。

2.2.2 提取溫度的選擇 精確稱取5 份粉碎的藏藥綠蘿花各3.0 g，置于100 ml 錐形瓶中，固定提取時(shí)間為30 min、80%乙醇為提取溶劑、液料比為12 ∶1、功率為300 W，考察提取溫度分別為25、35、45、55、65 ℃時(shí)總黃酮提取率的變化。提取溫度對(duì)總黃酮提取率的影響見(jiàn)圖1B。

圖1 各因素對(duì)總黃酮提取率影響的單因素試驗(yàn)A.提取時(shí)間；B.提取溫度；C.乙醇體積分?jǐn)?shù)；D.液料比；E.超聲功率Fig 1 Single-factor test for evaluating the effects of the factors on total flavonoidsA.extraction time；B.extraction temperature；C.volume fraction of ethanol；D.ratio of liquid to solid；E.ultrasonic power

由圖1B 可知，起初總黃酮提取率隨提取溫度上升而升高；提取溫度達(dá)到45 ℃時(shí)，總黃酮提取率達(dá)到最高；之后總黃酮提取率略有下降。分析其原因可能是由于提取溫度過(guò)高，對(duì)總黃酮的結(jié)構(gòu)有所破壞所致，以致總黃酮提取率下降，因此選擇提取溫度為45 ℃。

2.2.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)的選擇 精確稱取5 份粉碎的藏藥綠蘿花各3.0 g，置于100 ml錐形瓶中，固定提取時(shí)間為30 min、溫度為45 ℃、液料比為12 ∶1、功率為300 W，考察提取溶劑乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為50%、60%、70%、80%、90%時(shí)總黃酮提取率的變化。提取溶劑乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取率的影響見(jiàn)圖1C。

從圖1C中可知，總黃酮提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而升高；但當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于80%時(shí)，總黃酮提取率開(kāi)始下降。根據(jù)相似相溶原理，極性相似可達(dá)到最大溶解度，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)，總黃酮提取率達(dá)到峰值，即此時(shí)溶劑與溶質(zhì)極性相似，故選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%。

2.2.4 液料比的選擇 精確稱取5 份粉碎的藏藥綠蘿花各3.0 g，置于100 ml 錐形瓶中，固定提取時(shí)間為30 min、溫度為45 ℃、80%乙醇為提取溶劑、功率為300 W，考察液料比分別為9 ∶1、12 ∶1、15 ∶1、18 ∶1、21 ∶1時(shí)總黃酮提取率的變化。液料比對(duì)總黃酮提取率的影響見(jiàn)圖1D。

由圖1D可知，初始時(shí)總黃酮的提取率隨液料比增大而快速升高；當(dāng)液料比（ml/g）超過(guò)12 ∶1時(shí)，總黃酮提取率增加幅度不大，從節(jié)約原料的基礎(chǔ)考慮，選取液料比為12∶1。

2.2.5 超聲功率的選擇 精確稱取5 份粉碎的藏藥綠蘿花各3.0 g，置于100 ml 錐形瓶中，固定提取時(shí)間為30 min、溫度為45 ℃、80%乙醇為提取溶劑、液料比為12 ∶1，考察提取功率分別200、250、300、350、400 W 時(shí)總黃酮提取率的變化。提取功率對(duì)總黃酮提取率的影響見(jiàn)圖1E。

由圖1E可知，超聲功率對(duì)綠蘿花中總黃酮提取率的影響不大。

2.3 響應(yīng)面分析法優(yōu)選工藝

2.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)[9]單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，提取時(shí)間、提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)和液料比4個(gè)因素對(duì)藏藥綠蘿花中總黃酮的提取率都有較大影響，所以在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法進(jìn)行4 因素5 水平優(yōu)化試驗(yàn)。因素與水平見(jiàn)表1。

表1 因素與水平Tab 1 Factors and levels

按表1 選取各因素與水平進(jìn)行試驗(yàn)，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以找到最優(yōu)的條件覆蓋區(qū)域進(jìn)一步優(yōu)化提取工藝參數(shù)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)與統(tǒng)計(jì)分析軟件為Design Expert 7.1.3。

2.3.2 模型的建立及結(jié)果 根據(jù)響應(yīng)面法中的Box-Behnken設(shè)計(jì)方法進(jìn)行4因素5水平試驗(yàn)，將總黃酮提取率數(shù)據(jù)輸入，建立總黃酮提取率的二次回歸方程。試驗(yàn)的方案與結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果Tab 2 Box-Behnken design plan and its results

經(jīng)回歸得到二次回歸方程為：Y＝1.95+0.021X1－0.042X2+0.11X3+0.076X4－0.21X1X2－0.11X1X3+0.047X1X4－0.11X2X3+0.055X2X4+0.33X3X4－0.11X12－0.17X22－0.099X32－0.61X42。方程中，X1代表提取時(shí)間，X2代表提取溫度，X3代表乙醇體積分?jǐn)?shù)，X4代表液料比。由于這些因素都經(jīng)過(guò)響應(yīng)面處理，所以這些因素對(duì)提取率的影響程度可以用各項(xiàng)系數(shù)的絕對(duì)值大小決定。系數(shù)中有正數(shù)也有負(fù)數(shù)，表示影響的方向不同。從上述方程可以看出，各因素及其交互作用對(duì)總黃酮提取率影響較大的因素是X3、X1X2、X3X4、X22、X42。

2.3.3 試驗(yàn)分析 將表2 中數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，并通過(guò)Design Expert 7.1.3軟件繪制各因素影響總黃酮提取率的三維效應(yīng)面圖?；貧w統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見(jiàn)表3；三維效應(yīng)面圖見(jiàn)圖2。

表3 回歸統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果Tab 3 Results of regression analysis

從表3可以看出，偏回歸系數(shù)顯著的有X3、X1X2、X22、X42，表明這些因素及交互項(xiàng)對(duì)總黃酮的提取率影響較大；回歸系數(shù)最顯著的是X3X4項(xiàng)，也就是這個(gè)交互項(xiàng)對(duì)總黃酮的提取率的影響是最大的。用這個(gè)結(jié)果與上面得到的二次回歸方程的結(jié)果進(jìn)行比較，可以看出影響總黃酮提取率較大的項(xiàng)是一致的，表明上述方程有效。表3中回歸方程失擬檢驗(yàn)并不顯著，表明未知因素影響不大；而擬合檢驗(yàn)是極顯著的，因?yàn)椴厮幘G蘿花總黃酮提取率的變化規(guī)律是由這4個(gè)參數(shù)決定的，方程與實(shí)際情況的良好擬合，表明此方程能很好地對(duì)參數(shù)的變化規(guī)律進(jìn)行預(yù)測(cè)。

由圖2A可知，總黃酮提取率在乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%左右隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，延長(zhǎng)提取時(shí)間可以提高總黃酮的提取率，乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)高則會(huì)降低總黃酮的提取率。

由圖2B可知，較低的溫度條件下總黃酮提取率較低，溫度的影響比較顯著，而在提取溫度較高區(qū)域和乙醇體積分?jǐn)?shù)區(qū)域的交界處總黃酮提取率較低，即這2個(gè)因素的交互作用較其他因素的影響更大。其主要原因是，總黃酮溶解度與溫度有關(guān)，溫度低時(shí)總黃酮溶解度差，這時(shí)提高乙醇體積分?jǐn)?shù)有利于總黃酮析出。

圖2 各因素對(duì)黃酮提取率影響的效應(yīng)面圖A.提取時(shí)間與乙醇體積分?jǐn)?shù)；B.提取溫度與乙醇體積分?jǐn)?shù)；C.液料比與乙醇體積分?jǐn)?shù)；D.提取溫度與提取時(shí)間；E.液料比與提取時(shí)間；F.液料比與提取溫度Fig 2 Response surface figure for the effects of the factors on flavonoids extraction rateA.extraction time and the volume fraction of ethanol；B.extraction temperature and the volume fraction of ethanol；C.the ratio of liquid to solid and the volume fraction of ethanol；D.extraction temperature and extraction time；E.the ratio of liquid to solid and extraction time；F.the ratio of liquid to solid and extraction temperature

由圖2C可知，液料比在一定范圍內(nèi)可以使總黃酮的提取率達(dá)到最高，液料比的增加能使藏藥綠蘿花粉末與提取液的接觸面更大，從而可以加快總黃酮的析出速度以利于提取率的提高；但是乙醇體積分?jǐn)?shù)太大或者使用溶劑過(guò)多則會(huì)因?yàn)闈B透壓太大而降低提取率。所以這2 個(gè)因素相互作用影響對(duì)提取率的影響也很大。

由圖2D 可知，溫度越高總黃酮提取率就越大，而提取時(shí)間的影響卻局限在一定的范圍內(nèi)。提高溫度有利于總黃酮的析出，但是溫度太高也會(huì)破壞總黃酮的活性物質(zhì)，所以只有適當(dāng)?shù)奶岣邷囟炔⑶姨崛r(shí)間選擇較合理的情況下，才能提高總黃酮提取率。

由圖2E 可知，液料比和提取時(shí)間這2 個(gè)因素的交互作用比較明顯。雖然液料比增加能提高提取率，但還是受到提取時(shí)間的限制，所以有時(shí)液料比太大只會(huì)造成試劑的浪費(fèi)；而提取時(shí)間太長(zhǎng)而液料比又較少的情況下，則會(huì)造成用電浪費(fèi)。

由圖2F可知，液料比和提取溫度有明顯的交互作用，在這2個(gè)因素取值合適的情況下，總黃酮的提取率能達(dá)到最大。

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化最優(yōu)工藝參數(shù)及驗(yàn)證試驗(yàn)

在選取的4 個(gè)因素中，通過(guò)響應(yīng)面軟件的分析得出，藏藥綠蘿花總黃酮的最優(yōu)提取工藝參數(shù)為提取時(shí)間28.60 min、提取溫度43.53 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)78.37%、液料比13.22∶1（ml/g）。黃酮提取率的預(yù)測(cè)值為2.129 5%。進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證的時(shí)候，為了方便所取的工藝條件，都取整數(shù)，即：設(shè)置水溫度為44 ℃，采用78%的乙醇，以13∶1的液料比，提取時(shí)間為29 min。為了獲得較好的結(jié)果，以這個(gè)條件做3 組平行試驗(yàn)，得3 次總黃酮提取率的平均值為2.130%（RSD＝0.80%，n＝3），與理論值的相對(duì)誤差為0.005%，證明了模型的可行性，也表明響應(yīng)面法是一個(gè)較好的優(yōu)化工藝參數(shù)的方法。

3 討論

超聲輔助提取技術(shù)由于操作簡(jiǎn)便、節(jié)能、省時(shí)，近年來(lái)廣泛用于天然產(chǎn)物的浸提[5-8]。但是，由本次超聲輔助提取黃酮的試驗(yàn)結(jié)果可看出，某些因素的水平并不是越大或越高提取效果就越好，如提取溫度、提取時(shí)間等。因此，以超聲作為提取方法時(shí)，對(duì)提取因素和水平的優(yōu)化就顯得特別重要。中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化藏藥綠蘿花總黃酮超聲波輔助提取工藝，能夠全面地對(duì)各因素的影響進(jìn)行分析。本研究設(shè)計(jì)為4因素5水平，相對(duì)于3因素4水平的試驗(yàn)來(lái)說(shuō)，前者更全面且更具有說(shuō)服力。深入地對(duì)藏藥綠蘿花總黃酮的提純工藝進(jìn)行研究，是為了能夠更好地利用藏藥綠蘿花這類資源。因此，本試驗(yàn)具有一定的參考價(jià)值。

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