高 瑛，趙淑慧，陸 洋，溫 然（1.北京中醫(yī)醫(yī)院順義醫(yī)院，北京 101300；.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 10010）

骨愈搽劑處方來源于北京中醫(yī)醫(yī)院順義醫(yī)院骨外科治療骨性關(guān)節(jié)炎應(yīng)用多年的臨床經(jīng)驗方，由透骨草、雞血藤、艾葉、紅花等6味中藥組成，具有祛風(fēng)除濕、活血通絡(luò)的功效，將其制成搽劑后可具有使用攜帶方便、有效成分含量高且可控、患者依從性好等特點，更加適合現(xiàn)代社會廣泛應(yīng)用。該處方中有效成分以總黃酮為主，其含量最高，單體成分以羥基紅花黃色素A（HSYA）最明確，故本研究以總黃酮、HSYA 為指標(biāo)，考察骨愈搽劑的體外透皮情況，并比較兩指標(biāo)成分體外透皮行為的相關(guān)性，為骨愈搽劑的研制開發(fā)提供數(shù)據(jù)支持。根據(jù)2010年版《中國藥典》（一部）[1]及處方藥味透骨草、紅花、雞血藤[2-4]等相關(guān)文獻(xiàn)報道，總黃酮的含量以蘆丁為對照品，采用紫外-可見分光光度法測定，HSYA 的含量采用高效液相色譜法進(jìn)行測定。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1200 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；TU-1810 紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；BS 110S 電子分析天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；YB-P6 智能透皮試驗儀（天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠）；KQ5200DA超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

骨愈搽劑[北京中醫(yī)醫(yī)院順義醫(yī)院自制，批號：20120830，規(guī)格：1 g（生藥）/ml]；蘆丁對照品（批號：100080-200707，純度：90.5%，供紫外含量測定用）、HSYA 對照品（批號：111637-201106，純度：98%）均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈、磷酸為色譜純，乙醇等其他試劑均為分析純。

1.3 動物

2 方法與結(jié)果

2.1 小鼠皮膚的處理[5]

將小鼠斷頸處死，取適量脫毛膏均勻涂于小鼠腹部脫去鼠毛，取下腹皮，用干棉花將脂肪及黏液組織擦試干凈，用清水和生理鹽水反復(fù)沖洗后，包于鋁箔紙內(nèi)，于冰箱冷凍保存?zhèn)溆?。實驗前自然解凍，目測皮膚完整性，不得有任何破損。

2.2 總黃酮的含量測定

2.2.1 測定方法 將體外透皮試驗取出的4 ml接收液置于10 ml量瓶中，以NaNO2-Al（NO3）3為顯色劑顯色，即加入50 mg/ml NaNO2溶液0.4 ml，搖勻后靜置6 min；再加入100 mg/ml Al（NO3）3溶液0.4 ml，搖勻后靜置6 min；加 入100 mg/ml NaOH 溶液4.0 ml，再加50%乙醇定容至刻度，搖勻后再靜置15 min。以無接收液的陰性試劑為空白，采用紫外-可見分光光度法在511 nm波長處測定吸光度，計算接收液中總黃酮含量。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取蘆丁對照品溶液（0.16 mg/ml）0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 ml，分別置于10 ml 量瓶中，加50%乙醇至4.0 ml，按“2.2.1”項下方法顯色，以無蘆丁對照品溶液的陰性試劑為空白，分別在511 nm 波長處測定吸光度。以質(zhì)量濃度（c）為橫坐標(biāo)、吸光度（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為A＝10.552c－0.003 7（r＝0.999 7），蘆丁的線性范圍為0.008～0.064 mg/ml。

2.2.3 回收率試驗 取空白接收液，加入0.008、0.032、0.064 mg/ml 的蘆丁對照品溶液制備成樣品溶液，紫外-可見分光光度法測定總黃酮含量，每組平行操作3 份。結(jié)果，低、中、高質(zhì)量濃度樣品溶液的回收率分別為（101.74±1.25）%、（97.60±0.76）%、（99.11±0.59）%，RSD 分別為1.23%、0.78%、0.60%（n＝3）。

2.2.4 精密度試驗 按“2.2.3”項下方法制備低、中、高質(zhì)量濃度的樣品溶液，紫外-可見分光光度法測定，每組重復(fù)測定5次。結(jié)果，峰面積的RSD 分別為3.13%、1.22%、0.97%（n＝5），表明儀器精密度良好。

2.3 HSYA的含量測定[6]

2.3.1 色譜條件[7]色譜柱：DiamonsilTM-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-乙腈-0.7%磷酸（26 ∶2 ∶72，V/V/V），流速：1 ml/min；檢測波長：403 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μl。

2.3.2 供試品溶液的制備 將接收液用0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液即得供試品溶液。

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取HSYA 對照品3.03 mg，置于10 ml量瓶中，加25%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得母液。分別精密移取適量母液，加25%甲醇制成質(zhì)量濃度為0.015 15、0.030 3、0.090 9、0.151 5、0.303 0、0.757 5、1.212 0 mg/L 的對照品溶液，進(jìn)樣測定，記錄色譜。以質(zhì)量濃度（c）為橫坐標(biāo)、峰面積（A）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸分析，得回歸方程為A＝58.120c+0.015 9（r＝0.999 9），HSYA 線性范圍為0.015 15～1.212 0 mg/L。

2.4 體外透皮試驗

采用垂直式Franz 擴(kuò)散池法[8]，使用YB-P6 智能透皮試驗儀，上室為擴(kuò)散室，下室為接收室，擴(kuò)散室容積為23 ml，有效擴(kuò)散面積為3.14 cm2，恒溫水浴加熱，溫度37 ℃。試驗時，接收室加滿釋放介質(zhì)（20%乙醇-生理鹽水），將小鼠鼠皮附在接收室上，將其固定在兩室之間，再將藥液加于鼠皮上，排除氣泡。磁攪拌轉(zhuǎn)速設(shè)定為400 r/min，在設(shè)定的時間點l、2、4、6、8、12 h精密移取5 ml接收液，同時補(bǔ)加等量等溫的新鮮接收液。取4 ml 接收液按“2.2.1”項下方法測定接收液中總黃酮含量；其余接收液用0.45 μm微孔濾膜過濾得到樣品，按“2.3.1”項下方法測定HSYA含量。

根據(jù)公式計算不同取樣點總黃酮和HSYA 的單位面積累積滲透量：Q＝/A，式中Q為累積滲透量，A為有效經(jīng)皮吸收面積，V為接收液體積，Vi為取樣體積，cn為第n次取樣測得的接收液中藥物的質(zhì)量濃度；ci為第i（i≤n－1）個取樣點測得的接收液中藥物的質(zhì)量濃度；為取樣時帶走的藥物累積和。滲透吸收百分率＝（Q×A）/W×100%，其中W為給藥量。以藥物的Q對取樣時間t進(jìn)行線性回歸分析，所得斜率即為透過速率。骨愈搽劑中總黃酮和HSYA 的透皮吸收曲線圖見圖1，12 h內(nèi)的滲透吸收百分率見表1、表2，平均單位面積累積滲透量-時間模型擬合方程見表3、表4。

圖1 骨愈搽劑中總黃酮和HSYA的滲透吸收曲線圖（n＝5）Fig 1 Transdermal absorption curve of total flavonoids and HSYA in Guyu liniment（n＝5）

表1 12 h內(nèi)總黃酮的滲透吸收百分率Tab 1 Transdermal absorption percentage of total flavonoids within 12 h

表2 12 h內(nèi)HSYA的滲透吸收百分率Tab 2 Transdermal absorption percentage of HSYA within 12 h

表3 總黃酮平均單位面積累積滲透量-時間模型擬合方程Tab 3 Model fitting equation of average accumulative permeation quantity of total flavonoids per unit areatime

表4 HSYA平均單位面積累積滲透量-時間模型擬合方程Tab 4 Model fitting equation of average accumulative permeation quantity of HSYA per unit area-time

由表3 和表4 可知，骨愈搽劑中總黃酮和HSYA 的透皮吸收過程均符合Higuchi 方程，透過速率分別為126.24、47.516 μg/（cm2·h）。

3 討論

黃酮類化合物是一類具有C6-C3-C6結(jié)構(gòu)的低分子質(zhì)量化合物[9]，具有抗炎、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、抗病毒、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜等多方面藥理活性，為骨科常用中草藥的活性成分。黃酮類化合物對骨關(guān)節(jié)炎的治療作用已有廣泛研究，其可抑制滑膜組織的異常增殖、抑制關(guān)節(jié)軟骨病變、保護(hù)成骨細(xì)胞缺氧損傷、激活成骨細(xì)胞而促進(jìn)骨形成等[10-14]。因此，開發(fā)黃酮類化合物治療骨科疾病的相關(guān)制劑具有重要意義。

骨愈搽劑屬于經(jīng)皮給藥系統(tǒng)制劑，黃酮類化學(xué)成分主要通過釋放到達(dá)皮膚表面，進(jìn)而經(jīng)過表皮進(jìn)入血液循環(huán)發(fā)揮作用，藥物成分的透皮吸收速率會直接影響到臨床療效[15]。因此，藥物的滲透吸收百分率是評價經(jīng)皮給藥制劑的重要指標(biāo)。

本試驗研究發(fā)現(xiàn)，骨愈搽劑中總黃酮的透皮數(shù)據(jù)擬合符合Higuchi 方程，12 h 內(nèi)滲透吸收百分率為8.23%，透過速率為126.24 μg/（cm2·h）；HSYA 的透皮數(shù)據(jù)擬合亦符合Higuchi方程，12 h 內(nèi)滲透吸收百分率為28.12%，透過速率為47.516 μg/（cm2·h）。這說明骨愈搽劑中總黃酮和HSYA 的累積滲透量Q均隨時間t的增加而增加，并與t1/2有顯著相關(guān)性；總黃酮的透皮行為與單體黃酮HSYA的透皮行為具有相似性，均可用Higuchi 方程描述其透皮過程，屬于骨架擴(kuò)散型透皮給藥系統(tǒng)，具有長效緩釋的特點。然而，是否能用Higuchi 方程繼續(xù)描述骨愈搽劑處方中的其他單體黃酮成分以及Higuchi 方程是否為黃酮類化合物透皮吸收過程的通用方程，則需要更進(jìn)一步的研究。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：30、141.

[2]王丹，孫佳明，王貴金，等.紫外分光光度法測定珍珠透骨草中總黃酮的含量[J].世界科學(xué)技術(shù)：中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2007，9（6）：61.

[3]梁穎，裴瑾，萬德光.紅花黃色素中主要成分的含量測定[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2011，28（13）：1 349.

[4]黃鎖義，羅建華，張麗丹，等.雞血藤總黃酮的提取及對羥自由基的清除作用研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2007，18（9）：2 337.

[5]劉月環(huán)，陸洋，杜守穎，等.宣痹凝膠帖膏劑有效成分的透皮行為研究[J].中國中藥雜志，2012，37（9）：1 202.

[6]溫然，郝博，高瑛，等.骨愈方中羥基紅花黃色素A 的體外透皮性能考察[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2013，19（12）：40.

[7]王永新，徐榮，白霜.高效液相色譜法測定紅花散瘀膠囊中羥基紅花黃色素A 的含量[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2007，13（1）：12.

[8]田璐，張蜀，林華慶，等.經(jīng)皮給藥制劑體外透皮擴(kuò)散試驗方法的研究進(jìn)展[J].中國藥房，2012，23（29）：2 761.

[9]陳白靈.黃酮類化合物的藥理活性研究新進(jìn)展[J].海南醫(yī)學(xué)，2012，23（9）：119.

[10]許曉林，柳蔚，李世剛，等.黃酮類化合物治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎作用機(jī)制的研究進(jìn)展[J].中藥材，2013，36（8）：1 367.

[11]伍海昭，朱敏，詹紅生，等.骨碎補(bǔ)總黃酮對去卵巢大鼠骨組織Ⅰ型膠原表達(dá)及骨代謝的影響[J].中醫(yī)正骨，2014（4）：11.

[12]陳冠儒.葛根總黃酮對去勢大鼠骨質(zhì)疏松的保護(hù)作用[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2014，49（6）：759.

[13]韓桂秋，王鳴剛，陳克明，等.芒柄花素對體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞缺氧損傷的保護(hù)作用[J].中國藥理學(xué)通報，2011，27（5）：671.

[14]楊亞軍，楊中林，王冬春，等.蘆丁與槲皮素對成骨細(xì)胞代謝影響的比較研究[J].中藥材，2006，29（5）：467.

[15]傅旭春，梁文權(quán)，俞慶森.用理論參數(shù)預(yù)測藥物的經(jīng)皮滲透性[J].藥學(xué)學(xué)報，2001，36（2）：145.