黃金蘭，秦嫦云，周 楠，高 山，杜 偉，謝艷秋，王 霞，施 倩，吳登攀（徐州醫(yī)學院藥學院，江蘇徐州 221004）

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）又稱老年性癡呆，好發(fā)于老年人。在眾多的AD 發(fā)病機制學說中，氧化應激學說越來越受到學術界的重視，從氧化應激角度研發(fā)的防治AD 的新藥可延緩AD 病程的發(fā)展，對AD 的早期治療具有非常重要的意義。氧化應激是指氧化物超過了機體內源性的抗氧化能力從而引起分子氧化，產生高度活性的羥自由基及單個氧原子等活性氧類（ROS）。正常生理條件下，人體具備一個完整的抗氧化防御系統(tǒng)，如酶類抗氧化系統(tǒng)。所以機體的氧化水平與抗氧化水平在各種因素的參與下保持著動態(tài)平衡。當機體受到有害刺激時，ROS產生過多，氧化程度超出氧化物的清除能力，則可直接引起蛋白質、脂質和DNA等胞內大分子的氧化，損害細胞的基本結構，最終導致細胞死亡。研究發(fā)現，基本上所有的胞內大分子（蛋白質、DNA、脂質等）在AD患者的腦組織中都可以發(fā)現有氧化形式的存在，且氧化應激在AD患者發(fā)病早期就已經出現[1]。

目前，已發(fā)現的堿基氧化產物超過30種，其中鳥嘌呤氧化生成的8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）是最重要的變異源性物質，被公認為是DNA 氧化損傷的標志物[2]。研究發(fā)現，三七皂苷R1（Notoginsenoside R1，NGR1）可通過提高抗氧化物酶的活性，從而減輕氧化應激引起的神經元損傷[3-4]；還可通過提高神經元突觸可塑性而提高AD 模型小鼠學習記憶功能[5]。然而NGR1是否可以通過減輕氧化應激而改善AD小鼠學習記憶能力尚未見相關文獻報道。筆者擬以NGR1為研究對象，通過建立D-半乳糖誘導的氧化應激癡呆小鼠模型（即AD小鼠模型），探討NGR1對該模型小鼠學習記憶能力的影響，并通過檢測小鼠血清和腦組織中抗氧化酶系活性及腦組織內氧化產物的含量，初步闡明NGR1影響AD模型小鼠學習記憶能力的機制，為研發(fā)防治AD的新藥提供實驗依據。

1 材料

1.1 儀器

ACT-200 型水迷宮跟蹤分析系統(tǒng)（美國Coulbourn 公司）；722N 型可見分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）；Elx808 型酶標儀（美國BioTek 公司）；5804R 型高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）。

1.2 藥品與試劑

NGR1（南京廣潤生物制品有限公司，批號：GR-133-140324，純度：≥98.0%）；吡拉西坦片（廣東華南制藥有限公司，批號：110102，規(guī)格：每片0.4 g）；D-半乳糖（上海源葉生物科技有限公司，批號：YY11147）；總超氧化物歧化酶（T-SOD）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）試劑盒、過氧化氫酶（CAT）試劑盒（南京建成科技有限公司，批號：A001-1、A005、A007-1）：小鼠8-OHdG酶聯(lián)免疫分析試劑盒（徐州微科曼得生物工程有限公司，批號：V02165M）。

1.3 動物

2 方法

2.1 分組、造模及給藥

將50 只昆明小鼠隨機均分為正常組、模型組、陽性對照（吡拉西坦，150 mg/kg）組和NGR1低、高劑量（12.5、25 mg/kg）組（劑量根據預實驗結果設置），除正常組每日頸背部ih 等容生理鹽水外，其余各組每日頸背部ih 10%D-半乳糖（0.01 ml/g）以復制氧化應激引起的AD 小鼠模型，qd；并于造模同時ig 相應藥物，正常組和模型組ig蒸餾水，qd，連續(xù)4周。

2.2 小鼠記憶行為能力測定

給藥結束后，采用Morris 水迷宮試驗檢測小鼠的記憶行為能力。水迷宮為直徑150 cm、高50 cm 的圓形水池，水深約32 cm，其中放置一個直徑為17 cm、高30 cm的圓形平臺，水溫保持（25±2）℃。將小鼠面向池壁由4個入水點放入池中，記錄其90 s 內成功進駐平臺（小鼠找到平臺并在平臺上滯留5 s為成功進駐）所需時間。如在90 s內不能成功進駐平臺，則將其引上平臺并令其停留10 s。每只鼠每天訓練4次，兩次訓練時間間隔為30～40 min，共訓練4 d。獲得性訓練結束后，撤除平臺，將小鼠由原先平臺象限對側放入水中，記錄其在原平臺所在象限游泳的時間占總游泳時間的百分比，即原平臺象限游泳時間百分比。

2.3 小鼠血清及大腦組織樣品的制備

實驗動物行為學檢測后，對小鼠眼球取血并盛于離心管中，靜置30 min，待血液凝固后以離心半徑為8 cm（下同）、3 000 r/min 離心10 min，吸取上清（即血清）備用。再于冰臺上迅速剝離小鼠大腦組織，預冷生理鹽水漂洗，濾紙吸干多余水分后稱質量，按質量-體積比1 ∶9加入預冷生理鹽水，玻璃勻漿器制成10%的腦勻漿液，于高速冷凍離心機中以14 000 r/min離心10 min，取上清，并用二辛可酸（BCA）法檢測蛋白濃度。

2.4 指標檢測

采用可見分光光度法測定小鼠血清及腦組織中T-SOD、GSH-PX、CAT活性，具體操作按T-SOD、GSH-PX、CAT試劑盒說明書進行，并按試劑盒說明書中公式計算相應酶活力。采用酶聯(lián)免疫吸附法測定小鼠腦組織中8-OHdG含量，具體步驟及含量計算方法參見8-OHdG酶聯(lián)免疫分析試劑盒說明書。

2.5 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 NGR1對模型小鼠學習記憶能力的影響

與正常組比較，模型組小鼠的原平臺象限游泳時間百分比明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，各藥物組小鼠的原平臺象限游泳時間百分比明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），結果見表1。

表1 各組小鼠的原平臺象限游泳時間百分比測定結果（，n＝10）Tab 1 The results of the percentage of swimming time in original platform quadrant of mice in each group（，n＝10）

表1 各組小鼠的原平臺象限游泳時間百分比測定結果（，n＝10）Tab 1 The results of the percentage of swimming time in original platform quadrant of mice in each group（，n＝10）

注：與正常組比較，＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01Note：vs.normal group，＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.01

3.2 NGR1對模型小鼠血清及腦組織中T-SOD、GSH-PX 和CAT活性的影響

與正常組比較，模型組小鼠血清和腦組織中T-SOD、GSH-PX、CAT 的活性均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，NGR1低、高劑量組及陽性對照組血清和腦組織中T-SOD、GSH-PX、CAT的活性均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01或P＜0.05），結果見表2。

表2 各組小鼠血清及腦組織中T-SOD、GSH-PX和CAT活性檢測結果（，n＝10）Tab 2 The results of activities of T-SOD，GSH-PX and CAT in serum and cerebral tissue of mice in each group（，n＝10）

表2 各組小鼠血清及腦組織中T-SOD、GSH-PX和CAT活性檢測結果（，n＝10）Tab 2 The results of activities of T-SOD，GSH-PX and CAT in serum and cerebral tissue of mice in each group（，n＝10）

注：與正常組比較，＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.normal group，＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01

3.3 NGR1對模型小鼠腦組織中8-OHdG含量的影響

與正常對照組相比，模型組小鼠腦組織中8-OHdG含量升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，NGR1低、高劑量組及陽性對照組小鼠腦組織中8-OHdG含量降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），結果見表3。

表3 各組小鼠腦組織中8-OHdG 含量測定結果（，n＝10）Tab 3 The results of content determination of 8-OHdG in cerebral tissue of mice in each group（，n＝10）

表3 各組小鼠腦組織中8-OHdG 含量測定結果（，n＝10）Tab 3 The results of content determination of 8-OHdG in cerebral tissue of mice in each group（，n＝10）

注：與正常組比較，＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01Note：vs.normal group，＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.01

4 討論

D-半乳糖誘導的氧化應激AD模型是通過D-半乳糖誘導機體產生自由基、脂質過氧化等氧化應激反應，從而導致學習與記憶能力衰退的癡呆模型[6]。其造模周期短、衰老變化明顯、穩(wěn)定性好，是目前國際上較為公認的癡呆模型。本實驗建立D-半乳糖誘導AD小鼠模型，并在行為學、氧化與抗氧化應激方面對其進行評價。結果發(fā)現，與正常組比較，模型組小鼠的原平臺象限游泳時間百分比及血清和腦組織中T-SOD、GSH-PX 和CAT 的活性均明顯降低（P＜0.01），而腦組織中DNA 的氧化產物8-OHdG 含量則明顯升高（P＜0.01），此結果與文獻[7]報道一致，提示模型小鼠出現明顯衰老體征、記憶能力下降、抗氧化酶活力下降，D-半乳糖誘導的AD 模型是成功的。

文獻報道三七總皂苷（PNS）可通過降低AD 模型大鼠腦內氧化應激水平從而改善大鼠的學習記憶功能[8]，而作為PNS的主要單體成分之一的NGR1可通過提高抗氧化物酶的活性，從而減輕氧化應激引起的神經元損傷[1-2]。吡拉西坦是一種經典的腦代謝活化劑，其能夠增加腦血流量，促進代謝，增強腦部左右兩半球間神經信息的傳遞，具有較強的抗腦缺氧作用，可保護外源性傷害性刺激對大腦的損害，改善學習和記憶等功效[9]，故本實驗以其為陽性對照藥物。研究結果顯示，與模型組比較，給藥組小鼠的原平臺象限游泳時間百分比明顯延長（P＜0.01），提示NGR1可改善D-半乳糖誘導的AD模型小鼠的學習記憶能力；生化檢測結果顯示藥物處理組的小鼠血清和腦組織中T-SOD、GSH-PX 和CAT 的活性均高于模型組（P＜0.05 或P＜0.01），而腦組織中DNA 的氧化產物8-OHdG含量則明顯降低（P＜0.01），提示NGR1可提高氧化應激AD模型小鼠血清及腦組織中SOD、GSH和CAT的活性，并可顯著降低腦組織中DNA的氧化產物8-OHdG的水平。

綜上所述，NGR1可通過減輕氧化應激從而改善AD 模型小鼠的學習記憶能力，是有潛力的AD治療藥物。

[1]Galasko D，Montine TJ.Biomarkers of oxidative damage and inflammation in Alzheimer’s disease[J].Biomark Med，2010，4（1）：27.

[2]高玉楠，楊靖，宋沁馨，等.8-羥基脫氧鳥苷作為DNA 氧化損傷標志物在疾病診斷中的應用[J].藥物與臨床研究，2012，2（3）：223.

[3]Meng X，Wang M，Wang X，et al.Suppression of NADPH oxidase and mitochondrion-derived superoxide by notoginsenoside R1protects against cerebral ischemia-reperfusion injury through estrogen receptor-dependent activation of Akt/Nrf2 pathways[J].Free Radic Res，2014，48（7）：823.

[4]Meng X，Sun G，Ye J，et al.Notoginsenoside R1-mediated neuroprotection involves estrogen receptor-dependent crosstalk between Akt and ERK1/2 pathways：a novel mechanism of Nrf2/ARE signaling activation[J].Free Radic Res，2014，48（4）：445.

[5]Yan S，Li Z，Li H，et al.Notoginsenoside R1increases neuronal excitability and ameliorates synaptic and memory dysfunction following amyloid elevation[J].Sci Rep，2014，doi：10.1038/srep06352.

[6]初曉，姚如泳，韓志武，等.茶多酚對D-半乳糖致衰老小鼠免疫功能的調節(jié)作用[J].中國醫(yī)院藥學雜志，2006，26（5）：635.

[7]秦紅兵，楊朝曄，范憶江，等.D-半乳糖誘導衰老小鼠模型的建立與評價[J].中國組織工程研究與臨床康復，2009，13（7）：1 275.

[8]屈澤強，謝智光，王乃平，等.三七總皂苷抗衰老作用的實驗研究[J].廣州中醫(yī)藥大學學報，2005，22（2）：130.

[9]謝展雄，吳建偉，吳鐵松，等.吡拉西坦對D-半乳糖致衰老模型大鼠腦組織超氧化物歧化酶活性和丙二醛含量的影響[J].中國藥房，2009，20（19）：1 459.