王健安，黃成軍

(1.廣西壯族自治區(qū)南溪山醫(yī)院急診科，廣西 桂林 541002； 2.桂林市第三人民醫(yī)院肝病科，廣西 桂林 541002)

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腦出血患者血清細(xì)胞纖維連接蛋白的測(cè)定與臨床意義

王健安1，黃成軍2※

(1.廣西壯族自治區(qū)南溪山醫(yī)院急診科，廣西 桂林 541002； 2.桂林市第三人民醫(yī)院肝病科，廣西 桂林 541002)

摘要：目的探討腦出血患者血清細(xì)胞纖維連接蛋白(cFN)的表達(dá)水平與腦出血的關(guān)系。方法選擇2012 年4~9月廣西壯族自治區(qū)南溪山醫(yī)院收治的腦出血患者25例作為腦出血組,同期選擇健康體檢者25例作為健康對(duì)照組,應(yīng)用免疫印跡法(Western blot)和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)檢測(cè)腦出血患者入院后1、4、7 d的血清cFN表達(dá)水平，同時(shí)對(duì)應(yīng)檢測(cè)健康對(duì)照組血清cFN表達(dá)水平。結(jié)果Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，cFN在腦出血患者的表達(dá)水平顯著高于健康對(duì)照組；ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，腦出血組患者1、4、7 d血清cFN水平分別為(238±69)、(448±84)、(280±84) μg/L，對(duì)照組1、4、7 d血清cFN水平分別為(138±30)、(141±40)、(139±15) μg/L，兩組不同時(shí)點(diǎn)間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。相關(guān)性分析結(jié)果顯示cFN表達(dá)水平與血腫體積的大小呈正相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論腦出血患者血清cFN表達(dá)水平升高, cFN表達(dá)水平可能與腦出血患者預(yù)后有關(guān)，但尚需臨床大樣本的試驗(yàn)研究。

關(guān)鍵詞：腦出血；細(xì)胞纖維連接蛋白；預(yù)后

腦出血是全世界病死率和致殘率極高的常見(jiàn)病之一，其原因往往與腦動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓等有關(guān)，至今仍缺乏有效的治療方法,約40%的腦出血患者在發(fā)病1個(gè)月內(nèi)死亡，而存活者約66%會(huì)致殘[1]。近來(lái)在研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞纖維連接蛋白(cellular fibronectin,cFN)與心腦血管疾病有關(guān)，纖維連接蛋白是血管內(nèi)皮的一種糖蛋白，它的水平升高可以損傷血管內(nèi)皮，容易誘發(fā)腦出血。本研究采用免疫印跡法(Western blot)和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)受試者血清cFN表達(dá)水平，揭示cFN與腦出血的關(guān)系，為腦出血的診斷、治療、預(yù)后提供有利線索。

1資料與方法

1.1一般資料選擇2012 年4~9月廣西壯族自治區(qū)南溪山醫(yī)院收治的腦出血患者25例作為腦出血組,男15例、女10例, 年齡45～79歲，平均(62±11)歲?；颊哂谌朐?、4、7 d行頭顱CT掃描，然后根據(jù)多田公式：出血量(mL)=Π/6×長(zhǎng)(cm)×寬(cm)×高(cm)，計(jì)算腦血腫體積。選擇同期健康體檢者25例作為健康對(duì)照組，男17例、女8例,年齡48～75歲，平均(58±8)歲。兩組受試者性別、年齡等一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有均衡性。腦出血組患者均排除既往腦血管性疾病、使用抗凝劑、嚴(yán)重感染、嚴(yán)重心肝腎疾病及嚴(yán)重頭部外傷史。樣本采集時(shí)患者及健康人均知情同意，在自愿的條件下簽署知情同意書(shū)。

1.2主要儀器4 ℃冰箱(青島海爾公司)，5180R型高速低溫離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)，離心管(美國(guó)Corning公司)，雪花制冰機(jī)(日本SANYO公司)，蛋白電泳儀、電轉(zhuǎn)儀及附件、酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)，Odyssey紅外激光成像系統(tǒng)(美國(guó)Odyssey公司)。

1.3主要試劑十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰氨凝膠電泳儀，凝膠(SDS-PAGE)配制試劑盒(碧云天公司)，蛋白marker(加拿大Fermentas公司)，濾紙(英國(guó)whatman公司)，聚偏二氟乙烯膜(美國(guó)Millipore公司)，細(xì)胞纖維連接蛋白抗體(美國(guó)santa crus公司)，人細(xì)胞纖維連接蛋白ELISA試劑盒(美國(guó)Cusabio公司)，IRDye 680標(biāo)記羊抗鼠IgG二抗(美國(guó)LI-COR公司)。

1.4試驗(yàn)方法

1.4.1Western blot配制8% SDS-PAGE，將凝膠固定于電泳裝置上，各加入電泳緩沖液；血清樣本稀釋后，與上樣緩沖液混勻，于沸水中煮5 min，短暫離心后，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的順序依次將樣品小心加入上樣孔內(nèi)；往電泳槽中加入電泳緩沖液，然后按設(shè)定程序80 V/30 min，120 V/90 min電泳；電泳結(jié)束后，按恒流250 mA 1.5 h將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯膜上；之后進(jìn)行封閉，將膜蛋白面朝下放于一抗稀釋液面上，4 ℃搖床避光孵育過(guò)夜；用吸水紙將聚偏二氟乙烯膜多余的液體吸干，將膜蛋白面朝下放于二抗稀釋液上，室溫下避光孵育2 h；膜清洗后，用Odyssey紅外激光成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描。

1.4.2ELISA標(biāo)準(zhǔn)品按照說(shuō)明書(shū)分別按照1000、500、250、125、62.5、31.2、15.6、0 μg/L的濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線；各組血清樣本用樣本稀釋液進(jìn)行1∶500倍；然后將標(biāo)準(zhǔn)品與待測(cè)血清樣本加于酶標(biāo)板孔底部，輕輕晃動(dòng)，酶標(biāo)板加上覆膜，37 ℃孵育120 min；移去酶標(biāo)板上的液體，甩干，然后每孔加生物素標(biāo)記抗體工作液100 μL，37 ℃孵育60 min；移去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每孔加200 μL洗滌液，每次浸泡2 min，甩干；每孔加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素工作液100 μL，37 ℃孵育60 min；依次每孔加入底物溶液90 μL，37 ℃避光顯色；15 min內(nèi)于波長(zhǎng)450 nm酶標(biāo)儀上測(cè)量各孔的光密度(OD值)。

2結(jié)果

2.1Western blot結(jié)果Western blot結(jié)果顯示,腦出血患者的cFN表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，腦出血組患者血清cFN在1 d的表達(dá)水平升高，4 d后升高明顯、7 d后表達(dá)水平逐漸下降；健康對(duì)照組在1、4、7 d的血清cFN表達(dá)水平均較腦出血組低，且各個(gè)時(shí)期均無(wú)變化。見(jiàn)圖1。

圖1　腦出血組和對(duì)照組不同時(shí)點(diǎn)間細(xì)胞纖維連接蛋白的表達(dá)

2.2ELISA結(jié)果ELISA檢測(cè)顯示，兩組間4 d時(shí)血清cFN水平均升高，7 d時(shí)水平均下降，兩組不同時(shí)點(diǎn)間血清cFN水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而在健康對(duì)照組1、4、7 d的表達(dá)水平顯著低于腦出血組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

組別例數(shù)1d4d7d腦出血組25238±69448±84280±84健康對(duì)照組25138±30141±40139±15 組間F=47.01 P=0.001 不同時(shí)點(diǎn)間 F=53.86 P=0.001 組間·不同時(shí)點(diǎn)間F=50.10 P=0.001

cFN：細(xì)胞纖維連接蛋白

2.3腦出血患者血清cFN與血腫量的關(guān)系對(duì)腦出血患者血清中cFN水平與血腫量作散點(diǎn)圖，結(jié)果顯示，1、4、7 d的圖形分布趨勢(shì)呈直線趨勢(shì)，其絕對(duì)值呈顯著正相關(guān)(r1=0.961,P1=0.001；r4=0.962,P4=0.001；r7=0.937,P7=0.001)，見(jiàn)圖2。

cFN:細(xì)胞纖維連接蛋白圖2　血清cFN與血腫量的關(guān)系

3討論

腦出血是指原發(fā)性腦動(dòng)脈、腦靜脈或毛細(xì)血管破裂而非外傷等所致的腦實(shí)質(zhì)出血，發(fā)病率占腦卒中的10%～30%[1]。近年來(lái)發(fā)病年齡有愈來(lái)愈年輕的趨勢(shì)。腦出血是常見(jiàn)的急危重癥疾病，與缺血性梗死相比，其致殘率及病死率均較高，給社會(huì)和家庭帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。

隨著研究的不斷深入，人們對(duì)于腦出血病理?yè)p傷機(jī)制、治療、預(yù)后等認(rèn)識(shí)日益深入。研究表明，腦出血患者導(dǎo)致病情加重的原因除血腫本身的占位性損害外，尚與很多因素有關(guān)，如腦血腫周?chē)M織局部腦血流下降、腦血腫周?chē)M織水腫、血腦屏障受損、血液分解產(chǎn)物釋放多種生物活性物質(zhì)[2-5]。cFN是纖維連接蛋白的一員，一組具有多種生物活性的大分子糖蛋白，主要由肝細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和纖維母細(xì)胞等合成，對(duì)于血小板黏附有著重要作用[6]。近年來(lái)，cFN在腦血管疾病中的作用也日益受到重視，但多數(shù)研究都集中在它們與腦缺血的關(guān)系上，其與腦出血的關(guān)系研究甚少。

本研究通過(guò)Western blot證實(shí)了cFN在腦出血患者中的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，兩組間4 d時(shí)血清cFN水平均升高，7 d時(shí)水平均下降，兩組不同時(shí)點(diǎn)間血清cFN水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而在健康對(duì)照組1 、4、7 d的表達(dá)水平顯著低于腦出血組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。此外，利用ELISA技術(shù)測(cè)定了腦出血組及健康對(duì)照組血清cFN水平，發(fā)現(xiàn)腦出血患者血清中cFN顯著升高，與Western blot結(jié)果相吻合。Castellanos等[7-8]研究也發(fā)現(xiàn)，急性缺血性卒中溶栓治療后繼發(fā)出血的患者cFn水平明顯升高，出血越嚴(yán)重，cFN的水平也越高，cFN≥3600 μg/L時(shí)，預(yù)測(cè)出血發(fā)生的準(zhǔn)確性為100%。Silva等[9]分別檢測(cè)183例腦出血患者不同時(shí)間段血漿白細(xì)胞介素6、cFn等水平，發(fā)現(xiàn)在后繼出現(xiàn)血腫增大和預(yù)后較差的患者中，血漿細(xì)胞因子或炎性介質(zhì)的水平明顯升高，而且升高的值同血腫的大小呈正相關(guān)。至于腦出血患者血清中cFN明顯升高的具體機(jī)制尚未明確，其可能為腦血管疾病患者動(dòng)脈血管狀況均不同程度存在粥樣硬化以及粥樣斑塊的潰瘍，這些都可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞和纖維母細(xì)胞合成cFn增多，血清中cFn水平升高。cFN作為一個(gè)血小板整合素的配體參與血小板的黏附和聚集反應(yīng)，使之黏附、聚集于內(nèi)膜上，形成附壁血栓，從而加速止血[10]。

本研究通過(guò)探討cFN與腦出血的關(guān)系還發(fā)現(xiàn)腦出血的血腫體積越大，cFN的值也就越高，患者血清cFN水平與腦出血血腫體積呈正相關(guān)。其可能的原因是血腫壓迫周邊組織，缺血缺氧加重刺激細(xì)胞分泌釋放更多cFN，以保護(hù)機(jī)體。這也提示定期測(cè)定患者血清cFN水平，有助于判斷腦出血患者病情嚴(yán)重程度。但本研究只是初步了解腦出血患者血清cFN情況，至于cFN與腦出血患者的預(yù)后關(guān)系，尚需進(jìn)一步的試驗(yàn)研究。

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Determination of Plasma Cellular Fibronectin Concentration in Patients with Intracerebral Hemorrhage and Its Clinical Significance

WANGJian-an1,HUANGCheng-jun2.

(1.DepartmentofEmergency,NanxishanHospitalintheGuangxiZhuangAutonomousRegion,Guilin541000,China; 2.DepartmentofHepatopathy,GuilinCityThirdPeople′sHospital,Guilin541002,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate serum cellular fibronectin(cFN) levels in patients with intracerebral hemorrhage and its correlation with cerebral hemorrhage.MethodsA total of 25 cases of cerebral hemorrhage from Guanyang County People′s Hospital from Apr. 2012 to Sep. 2012 were included as the hemorrhage group, and another 25 healthy objects were included as control group.cFN expression level in serum samples of both groups at 1,4,7 d after the onset of stroke was measured by Western blot and enzyme-linked immunosorbent assay.ResultsWestern blot analysis showed that the cFN expression level in the hemorrhage group was significantly higher than the control group.The enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) indicated that levels of serum cFN were significant higher in the hemorrhage group at each time point after onset than those in the control group.The highest level of serum cFN was found at 4 days. The levels of serum cFN in hemorrhage group at 1,4,7 d after onset were:(238±69)，(448±84)，(280±84) μg/L;while in the control group were:(138±30) ，(141±40)，(139±15) μg/L,the differences between the two groups at each time point were statistically significant(P<0.05).Correlation analysis showed cFN level was positively correlated with the brain edema volume(P<0.05).ConclusionThe serum cFN expression level is higher in hemorrhage patients, and may be associated with the prognosis of the patients,though further validation by large clinical samples study is still needed.

Key words:Intracerebral hemorrhage; Cellular fibronectin; Prognosis

收稿日期：2014-01-26修回日期：2014-07-16編輯：伊姍

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.01.048

中圖分類(lèi)號(hào)：R743.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-2084(2015)01-0121-03