田　虎，張繼紅*，孫和龍，高　瑩，俞可欣，王先友

(湘潭大學(xué)　a.化工學(xué)院； b.化學(xué)學(xué)院， 湖南 湘潭 411105)

番茄采后寄生菌的分離鑒定及(E)-2-己烯醛抑菌活性研究

田虎a，張繼紅a*，孫和龍a，高瑩a，俞可欣a，王先友b*

(湘潭大學(xué)a.化工學(xué)院； b.化學(xué)學(xué)院， 湖南 湘潭 411105)

摘要：番茄采后儲藏、運輸中遭受的病害有很多，嚴(yán)重影響了番茄的品質(zhì)。生物防治因低毒、高效，已作為控制采后病害的新途徑，成為研究熱點。本文主要對采后成熟番茄表面寄生菌進(jìn)行分離純化，通過形態(tài)特征、生理生化特性、rDNA-ITS序列分析以及系統(tǒng)發(fā)育分析對該菌株進(jìn)行鑒定，并通過不同濃度(E)-2-己烯醛對該菌種進(jìn)行抑菌分析。采用真菌通用引物擴(kuò)增18S rDNA基因，得到PCR產(chǎn)物(約500 bp)。測序后，NCBI數(shù)據(jù)庫比對可知，確定其為圓弧青霉菌(Penicillium cyclopium)。根據(jù)圓弧青霉的生長曲線可知，生長60-72 h，其生物量達(dá)到最大，其最適溫度為25-30 ℃，最適pH為5.0。抑菌結(jié)果顯示，(E)-2-己烯醛對圓弧青霉的菌絲生長有較好的抑制作用，對菌絲生長的最低抑菌濃度(MIC)為160 μL/L。

關(guān)鍵詞：番茄，菌株鑒定，rDNA-ITS序列分析，圓弧青霉，(E)-2-己烯醛，抑菌活性

番茄為茄科草本植物，漿果，皮薄肉厚，含水量達(dá)95%，作為一種重要的農(nóng)產(chǎn)品。在采摘和運輸過程中極易受到機(jī)械損傷，從而易受真菌入侵。番茄采后病原菌，包括灰霉病使番茄產(chǎn)量造成重大損失[1]，番茄的病害是影響番茄品質(zhì)的重要因素之一。

番茄采后儲存和運輸中遭受的病害有許多，其中主要包括番茄早疫病，青霉果腐病，番茄實腐病等。目前，對番茄采后病害的防治仍然以化學(xué)防治為主。長期、過量使用化學(xué)農(nóng)藥，不但成本高，殘留多，還容易產(chǎn)生抗藥性。生物防治已被證明在許多作物有效，因無毒、高效、成本低，作為控制采后病害的新途徑，成為研究熱點[2]。

近年來，天然抑菌劑受到人們廣泛關(guān)注，前人在果蔬保鮮儲藏方面做了不少研究。茶樹油熏蒸能有效抑制草莓灰霉病致病菌的菌絲生長和孢子萌發(fā)，維持草莓果實的品質(zhì)，延長其保鮮期[3]。Smid等[4]研究表明，肉桂醛能明顯降低番茄果實表面和萼部的細(xì)菌和真菌的數(shù)量，從而對番茄表面進(jìn)行消毒。拮抗微生物的應(yīng)用被證明是一種行之有效的方法[5, 6]。鈣能提高酵母菌Candida guilliermondii和Pichia membranefaciens對桃采后軟腐病的防治能力[7]。水楊酸對增強(qiáng)酵母拮抗菌Rhodotorula glutinis防治甜櫻桃采后病害的效果顯著[8]。

E-2-己烯醛作為一種綠葉揮發(fā)性物質(zhì)(GLVs)，已被證明對真菌、革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌具有明顯的抑菌活性[9-11]。Patrignani等[12]研究發(fā)現(xiàn)，亞致死劑量的E-2-己烯醛能顯著改變四種病原細(xì)菌細(xì)胞膜及揮發(fā)性物質(zhì)的組成。迄今為止，E-2-己烯醛對番茄采后寄生菌菌絲的抑制作用的報道較少。鑒于此，從采后番茄表面分離純化得到一個菌株，本研究從寄生菌株的形態(tài)特征、生理生化特性、18 S rRNA-ITS PCR擴(kuò)增、基因序列比對等方法對菌株進(jìn)行鑒定。本試驗研究E-2-己烯醛對該菌株的抑制作用，測定其最低抑菌濃度(MIC)，用以防治番茄采后病害。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株和試劑

番茄寄生真菌由湘潭大學(xué)微生物實驗室從采后番茄表明分離、保存。Taq DNA 聚合酶、dNTPs、膠回收試劑盒均購買自天根(TIANGEN)公司。18S rDNA引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.1.2培養(yǎng)基

牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，瓊脂15-20 g，Nacl 5 g，pH值7.0，最后用雙蒸水定容至1 000 mL，121 ℃、1.01×105 Pa 滅菌25 min，倒平板，冷卻形成固體培養(yǎng)基(PDA)[20]；

1.2番茄寄生菌的分離

在無菌操作臺下，用接種環(huán)挑取番茄的真菌，用加有0.05%的Tween 80(w/v)的滅菌雙蒸水制成菌懸液，濃度約為1.0x105CFU/mL，涂布到PDA培養(yǎng)基上，Parafilm封口膜密封，倒置，28 ℃培養(yǎng)3-4 d。將長出的菌落挑出，劃線分離純化，得到的菌株50%甘油-80 ℃保存，以便后續(xù)觀察、備用。

1.3菌株的鑒定及生物學(xué)特性分析

1.3.118s rDNA-ITS序列分析

番茄寄生的真菌基因組DNA的提取采用改良的氯化芐法[13]，并以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，18S rDNA 基因克隆的PCR 引物為ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCG-3′) 和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。PCR 擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35 個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。所得PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，膠回收后，由上海生工生物有限公司完成測序。將所測得的18S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的18S rDNA序列進(jìn)行相似性比較，并用MEGA5.0軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.3.2寄生真菌的形態(tài)學(xué)觀察[14]

取菌絲體樣品于超凈菌臺，置于2.5%的戊二醛溶液中4 ℃固定過夜。然后倒掉戊二醛溶液，用0.1 mol/L pH7.0的磷酸緩沖液清洗三次，每次5 min，30%，50%，70%，80%，90%和95%濃度的乙醇溶液分別對樣品進(jìn)行梯度脫水，每次處理持續(xù)15 min，再用100%的乙醇處理30 min，用叔丁醇代替乙醇繼續(xù)處理45 min，所得樣品真空冷凍干燥過夜，最后干燥好的樣品經(jīng)離子濺射鍍膜機(jī)噴金后，在JEOL JSM-6360LV型掃描電鏡中觀察。

1.3.3寄生真菌生長曲線的測定

取50 μL的菌懸液加入到裝有50 mL已滅菌的PDA液體培養(yǎng)液的錐形瓶中，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱140 r/min震蕩培養(yǎng)，每隔12 h經(jīng)真空過濾，50 ℃恒溫干燥，稱取菌絲體干重[15]。每組重復(fù)3次，取平均值。

1.3.4溫度對菌絲體生長的影響

取100 μL的菌懸液均勻涂布在PDA上培養(yǎng)2 d，沿菌絲生長前沿，用內(nèi)徑為5.5 mm的無菌打孔器打下菌臺，置于滅菌的PDA平板中央。設(shè)置7個溫度梯度，分別為5 ℃，10 ℃，15 ℃，20 ℃，25 ℃，30 ℃，35 ℃，每組重復(fù)3次，培養(yǎng)3 d后，采用十字交叉法測量菌落直徑，取平均值。

1.3.5pH對菌絲生長體的影響

取100 μL的菌懸液均勻涂布于已滅菌的PDA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 d，沿菌絲生長前沿，用內(nèi)徑為5.5 mm的無菌打孔器打下菌臺，置于已滅菌的PDA平板中央。然后，分別將菌臺置于pH值為4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0的已滅菌的PDA固體培養(yǎng)基平板中央，30 ℃倒置培養(yǎng)，每組梯度重復(fù)3次，培養(yǎng)3 d后，采用十字交叉法測量菌落直徑，取平均值。

1.3.6真菌分生孢子的致死溫度

取10 mL 1×105CFU/ml的致病菌懸浮液裝于試管中，當(dāng)水浴溫度達(dá)到預(yù)定值時分別將試管移入水浴鍋中并開始計時，以40 ℃為起點，以5 ℃的梯度遞增，直至80 ℃。試管分別加熱10 min，最后移取0.1 mL菌懸液于滅菌的PDA固體培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫倒置培養(yǎng)2 d。每溫度梯度重復(fù)三次，觀察并判斷病原菌在培養(yǎng)基上菌落生長情況。

1.3.7己烯醛對寄生真菌最低抑菌濃度(MIC)的測定

以己烯醛為原液，用乙醇稀釋，過濾滅菌，制備成20 ml/L的己烯醛母液。分別吸取己烯醛母液，加入剛滅菌的PDA固體培養(yǎng)基中，混勻，則培養(yǎng)基含己烯醛濃度依次為0，10，20，40，80，160，320 μL/mL，凝固后，用內(nèi)徑為5.5 mm的無菌打孔器在培養(yǎng)2 d的圓弧青霉PDA固體培養(yǎng)基平板中打下菌臺，接種到上述的平板上。

30 ℃恒溫培養(yǎng)2 d，采用十字交叉法測量菌落直徑，每個實驗4次重復(fù)，取平均值。以完全無菌生長的最低己烯醛濃度為己烯醛對該菌的最低抑菌濃度(MIC)。將沒有生長的菌苔移接到新的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)2 d，肉眼看不到任何菌絲體生長的最低濃度認(rèn)為該組分的最低殺菌濃度(MFC)。

2結(jié)果與分析

2.1番茄采后寄生菌的鑒定

2.1.1番茄寄生菌的形態(tài)特征

番茄寄生菌在固體PDA培養(yǎng)基上前期形成為白色菌落，反面無色或帶黃色，后期轉(zhuǎn)為深綠色，菌落反面赭褐色，菌落較厚，表面有顆粒狀物質(zhì)，中央凸起，具放射狀皺紋，質(zhì)地絲柔狀。其菌絲的形態(tài)為帚狀枝三輪生，有些二輪生，不對稱，梗頸較短，分生孢子球形或近球形，壁光滑，如圖1所示。

圖1　番茄寄生菌的掃描電鏡照片(1000×)Fig.1　The scanning electron micrograph of parasitic fungus of tomato fruits(1000×)

2.1.218S rDNA-ITS基因擴(kuò)增及序列分析

對番茄寄生菌株利用氯化芐法提取DNA，并進(jìn)行ITS序列擴(kuò)增，其擴(kuò)增產(chǎn)物大小為550 bp左右，如圖2所示。所得序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)該菌株與Penicillium cyclopium strain CICC 4026 的核苷酸序列同源性高達(dá)99%。結(jié)合番茄寄生菌的形態(tài)特征，其鑒定結(jié)果為圓弧青霉(Penicillium cyclopium)。從NCBI數(shù)據(jù)庫中搜尋與圓弧青霉同一種屬的青霉模式菌株，下載其ITS基因序列，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹 (圖3)。

2.1.3圓弧青霉(Penicillium cyclopium)的生長曲線

從圖4中可見，圓弧青霉菌株在0～24 h內(nèi)菌絲體重量變化不明顯，處于延滯期，菌體為適應(yīng)新的環(huán)境而表現(xiàn)出生長遲緩，幾乎不繁殖，故而菌絲體干重幾乎不變；在24～60 h進(jìn)入對數(shù)生長期，菌絲體干重呈指數(shù)倍增加，菌株生長很旺盛，；在60～72 h進(jìn)入平穩(wěn)期，菌株菌絲體重量趨于平衡，變化不明顯，生長速度等于死亡速度。

圖2　18S rDNA-ITS基因擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.2　The electrophoretic results of PCR products of 18S-rDNA-ITS

2.1.4溫度對圓弧青霉(Penicillium cyclopium)菌絲體生長的影響

由圖5可知，培養(yǎng)溫度為10 ℃-25 ℃時，菌落生長直徑呈上升的趨勢，培養(yǎng)溫度為30 ℃-35 ℃時，菌落生長直徑呈明顯下降的趨勢，圓弧青霉菌絲體在5 ℃幾乎不生長，35 ℃時菌絲生長量很少，直徑只有6 mm左右，接種菌臺為5.5 mm。較高(35 ℃)和較低(10 ℃)溫度下該菌絲體的生長均受到明顯抑制，因此25 ℃-30 ℃為圓弧青霉培養(yǎng)的最適溫度范圍，菌落生長直徑較大。

2.1.5pH對圓弧青霉(Penicillium cyclopium)菌絲體生長的影響

圓弧青霉菌在pH4.0-10.0的范圍內(nèi)均能生長(圖6)，由圖可知，酸性條件下有利于該菌株的生長，pH為5.0時菌落的直徑最大，達(dá)到13.5 mm，隨著pH值的升高，菌落直徑逐漸變小，pH值為10.0時，菌落幾乎不生長，接種菌臺直徑為5.5 mm。

2.1.6圓弧青霉(Penicillium cyclopium)分生孢子的致死溫度

由表1可知，圓弧青霉孢子懸浮液經(jīng)不同溫度處理后，分別涂板，恒溫培養(yǎng)2 d后，檢測菌落數(shù)以顯示該菌對溫度的敏感性。隨著處理溫度的升高，菌落數(shù)急劇減少，溫度達(dá)到70 ℃時，肉眼基本觀察不到菌落，由此可知，圓弧青霉分生孢子的致死溫度為70 ℃。

表1圓弧青霉(Penicillium cyclopium)分生孢子致死溫度的測定

Tab.1The determination of lethal temperature of the conidiophores of Penicillium cyclopium

溫度(℃)4550556065707580菌落數(shù)++++++++---

注：+++表示菌落數(shù)很多；++表示菌落數(shù)可數(shù)；+表示菌落數(shù)極少；-表示沒有菌落

圖3　番茄寄生菌Penicillium cyclopium ITS基因部分序列構(gòu)建的N-J系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3　Pheylogenetic analysis of ITS sequence of Penicillium cyclopium fungi of tomato fruits

圖4　圓弧青霉(Penicillium cyclopium)的生長曲線Fig.4　The growth curve of Penicillium cyclopium

圖5　不同溫度對圓弧青霉(Penicillium cyclopium)菌絲體生長的影響Fig.5　The influence of different temperature on Penicillium cyclopium mycelium growth

圖6　pH對圓弧青霉(Penicillium cyclopium)菌絲體生長的影響Fig.6　The influence of pH on the Penicillium cyclopium mycelium growth

2.2(E)-2-己烯醛最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MFC)測定結(jié)果

由表2可知，各濃度(E)-2-己烯醛對圓弧青霉均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌效果，隨著PDA固體培養(yǎng)基中(E)-2-己烯醛濃度的升高，培養(yǎng)皿中的圓弧青霉菌落的直徑逐漸變小，說明抑菌的效果越明顯。(E)-2-己烯醛對圓弧青霉的MIC為160 μl/L，MFC為320 μl/L。

表2(E)-2-己烯醛對圓弧青霉(Penicilliumcyclopium)的MIC和MFC(μl/L)測定

Tab.2The determination of MIC and MFC of E-2-Hexenal onPenicilliumcyclopium

(E)-2-己烯醛濃度(μl/L)菌落直徑(mm)022.75±1.881022.69±1.312019.69±1.414013.5±1.83809.13±0.881605.5±03205.5±0

注：接種菌苔直徑為5.5 mm

3結(jié)論與展望

大量研究表明，從芳香植物或中草藥中提取的精油類物質(zhì)具有抑菌或殺菌的活性，可作為天然的食品防腐劑[16]。植物揮發(fā)物已被廣泛用于食品調(diào)味劑，其中大部分普遍被公認(rèn)為是安全的[17]。GC/MS測定番茄葉中，含量最高的揮發(fā)組分為(E)-2-己烯醛，普遍存在于各種綠色植物中，被稱為“綠葉氣味”[18]。本研究根據(jù)寄生真菌形態(tài)學(xué)特征結(jié)合18S rDNA-ITS分子檢測結(jié)果，對照《真菌鑒定手冊》，對采后番茄寄生真菌進(jìn)行分離純化鑒定。結(jié)果表明，該菌株與以往報道的圓弧青霉菌rDNA-ITS序列同源性為99%，可以判斷該菌株為圓弧青霉(Penicilliumcyclopium)。

根據(jù)對圓弧青霉的生長曲線、溫度、pH值及致死溫度研究，了解此種圓弧青霉的生長特性。從圓弧青霉的生長曲線可知，當(dāng)菌絲生長60-72 h，其生物量達(dá)到最大，最適溫度為25-30 ℃，最適pH為5.0。本實驗采用菌絲生長速率法測定了(E)-2-己烯醛對圓弧青霉的影響，結(jié)果表明，(E)-2-己烯醛對圓弧青霉的菌絲生長有較好的抑制作用，對菌絲生長的最低抑菌濃度(MIC)為160 μl/L。乙醛部分跟巰基基團(tuán)在生理條件下起反應(yīng)主要是通過1,4-加成[19]。其他醛的抗菌作用機(jī)制，如戊二醛和鄰苯二甲醛，可能涉及與細(xì)胞質(zhì)膜的相互作用，增加其滲透率[20, 21]。從橄欖中提取的醛展示出對紅色毛癬菌和犬小孢子菌株顯著的抗真菌活性。不飽和醛類對所有的癬菌顯示出更強(qiáng)的活性，其MIC值小于1.9 μg/mL，尤其是(E)-2-己烯醛和(E)-2-壬烯醛較相應(yīng)的飽和己醛和壬醛顯示出更廣譜的抗性[22]。

本研究所分離的番茄圓弧青霉病菌，可為探討番茄果實采后防腐保鮮提供實驗材料。而(E)-2-己烯醛對番茄采后圓弧青霉病菌的抑菌作用，為(E)-2-己烯醛在番茄果實的貯藏保鮮上提供一定的理論和實踐依據(jù)。

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Isolation&Identification of Bacteria from Postharvest Tomato and A Study on the Antibacterial Activity of (E)-2-Hexenal

TIANHua,ZHANGJihonga*,SUNHelonga,GAOYinga,YUKexina,WANGXianyoub*

(Xiangtan University a.College of Chemical Engineering; b.College of Chemistry, Xiangtan 411105, Hunan, China)

Abstract：There were many diseases of tomato during postharvest storage and transportation, which seriously affect the quality of tomato. Because of low toxicity and high efficiency, biological control had been used as a new way to control postharvest diseases, became research hotspot. The paper mainly focused on the isolation and purification of the parasitic bacteria on the surface of the mature tomato, the bacterial strains were identified by morphological characteristics, physiological and biochemical characteristics, rDNA-ITS sequence analysis and phylogenetic analysis. Antibacterial activity of different concentrations of (E)-2-Hexenal against the bacterial strains were analysed. 18 S rDNA genes were amplified by using universal fungal primers, PCR products (about 500 bp) were obtained. After sequencing, the bacterial strains were determined to be Penicillium cyclopium by blasting in NCBI database. According to the growth curve of Penicillium cyclopium, which can be learned that the biomass reached the maximum around 60-72h, the optimum temperature was 25-30 ℃, the optimum pH was 5.0. The antibacterial results showed (E)-2-Hexenal treatment was significantly effectives against mycelial growth of Penicillium cyclopium, the MIC was 160 μl/L in growth inhibition assays.

Key words：tomato; strain identification; rDNA-ITS sequential analysis; penicillium cyclopium; (E)-2-Hexenal; antibacterial activity

文章編號：1007-7146(2015)06-0545-06

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

中圖分類號：Q939.99

*通訊作者：張繼紅(1977-)，男，湖南湘鄉(xiāng)人，湘潭大學(xué)副教授，碩士生導(dǎo)師，從事生物化學(xué)與分析檢測研究。(電話)0731-58292246；(電子郵箱)jihongzh01@xtu.edu.cn；王先友(1963-)，男，湖南湘鄉(xiāng)人，湘潭大學(xué)教授，博士生導(dǎo)師，從事新型電源及電極研究。(電話)0731-58292060；(電子郵箱)xywang@xtu.edu.cn

作者簡介：田虎(1989-)，男，湖南岳陽人，碩士研究生，主要從事植物病理與農(nóng)產(chǎn)品儲藏研究。

基金項目：湖南省自然科學(xué)基金項目(15JJ6108);湘潭大學(xué)博士啟動經(jīng)費(KZ08033)

收稿日期：2015-07-24;修回日期:2015-10-15

doi:10.3969/j.issn.1007-7146.2015.06.010