郝文麗，陳志寶，趙　蕊，薄　樂，張騰龍

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 黑龍江 大慶 163319)

復(fù)合因素建立亞健康小鼠模型

郝文麗，陳志寶，趙蕊*，薄樂，張騰龍

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 黑龍江 大慶 163319)

摘要：目的:復(fù)合因素建立與臨床癥狀相似的亞健康小鼠模型。方法:采用強(qiáng)迫游泳、睡眠剝奪、裝管束縛、夾鼠尾應(yīng)激建立亞健康小鼠模型，通過小鼠外觀、行為學(xué)數(shù)據(jù)及病理檢測鑒定模型是否成功。結(jié)果:造模結(jié)束后，模型組小鼠外觀、體重、自主活動(dòng)量、避暗次數(shù)、絕望時(shí)間、力竭游泳時(shí)間與對(duì)照組小鼠相比差異顯著(P<0.05)，病理結(jié)果顯示模型組小鼠未見異常。結(jié)論:復(fù)合因素成功建立亞健康小鼠模型。

關(guān)鍵詞：復(fù)合因素; 亞健康模型; 小鼠

隨著社會(huì)的發(fā)展，人們生活環(huán)境的改變以及社會(huì)競爭的日趨激烈，很多人日漸出現(xiàn)疲勞、失眠、虛弱、健忘、抑郁、易怒、易緊張等癥狀，且檢查機(jī)體未有患病癥狀，這種健康與疾病之間的狀態(tài)被稱為亞健康狀態(tài)(sub-health)，人們習(xí)慣將其稱為第三狀態(tài)或灰色狀態(tài)[1-3]。亞健康屬未病范疇且是未病之一，已成為危害人類健康的重大隱患之一，以疲勞、活力減退、免疫力降低、記憶力下降為主要的臨床表現(xiàn)。亞健康問題受到了國內(nèi)外學(xué)者們的高度關(guān)注，然而卻未見統(tǒng)一的亞健康模型的建立標(biāo)準(zhǔn)。常見單一因素即應(yīng)激刺激、強(qiáng)迫游泳、限制運(yùn)動(dòng)等建模方法，未能全面考慮亞健康多由于軀體、心理、社會(huì)競爭等共同因素作用而形成的。本實(shí)驗(yàn)綜合考慮亞健康的主要成因及臨床表現(xiàn)，既往研究單一因素[4-8]及少數(shù)復(fù)合因素[9,10]建模的基礎(chǔ)上，加以改進(jìn)，采用強(qiáng)迫游泳、睡眠剝奪、束縛、夾鼠尾應(yīng)激來建立模型，通過小鼠的表觀現(xiàn)象、行為學(xué)數(shù)據(jù)以及肝臟、腎、胸腺、脾的病理觀察，來驗(yàn)證是否成功建立亞健康模型。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)健康昆明小鼠，雄性，4周齡，18-22 g，購于長春醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2主要儀器

S 多功能小鼠自主活動(dòng)分析儀、避暗穿梭儀

1.3亞健康模型的建立

雄性昆明小鼠(50只)飼養(yǎng)適應(yīng)一周后，隨機(jī)分2組，使得兩組鼠的體重平均值基本相同。對(duì)照組(10只)正常無菌飼養(yǎng)，建模組(40只)用于建立亞健康模型。所有小鼠飼養(yǎng)用品及實(shí)驗(yàn)用品都定期進(jìn)行滅菌消毒。

1.3.1游泳建模

制作直徑為100 cm的游泳池，水深30 cm，水溫25 ℃左右，溫度過高小鼠易暈厥，溫度過冷，小鼠易抽筋溺水。每天8∶00將小鼠放入水中，強(qiáng)迫游泳50 min，14∶00強(qiáng)迫游泳50 min，其余時(shí)間睡眠剝奪，直至每天20∶00結(jié)束。游泳過程中動(dòng)物如體力不支沉入水中，及時(shí)撈出，防止溺死。

1.3.2睡眠剝奪建模

在游泳池中放置l個(gè)直徑為55 cm、高31 cm的圓圈鐵絲網(wǎng)平臺(tái)(平臺(tái)面距水面約1. 0 cm)，供小鼠休息，若其睡眠，則由于肌肉張力松弛而落入水中。

1.3.3束縛建模

第三周開始裝管束縛(50 mL離心管穿孔)，保持空氣通暢，小鼠禁食不禁水。每天22∶00裝管，次日6∶00放出，共7 d。

1.3.4應(yīng)激建模

第四周開始每天20∶00將動(dòng)物從平臺(tái)上取下，吹干處理后放入飼養(yǎng)籠中自由進(jìn)食飲水，防止動(dòng)物因受潮受涼而患病。用尖端纏有紗布的止血鉗夾小鼠尾部，夾尾已不破皮不流血不斷尾為度，建模過程中保證每只鼠夾尾次數(shù)一致，隨機(jī)更換小鼠夾尾。每次刺激1 h。22∶00時(shí)去除止血鉗，全天造模結(jié)束。

建模28 d結(jié)束后觀察小鼠精神狀態(tài)、皮毛、排便；稱量建模28 d后對(duì)照組小鼠和模型組小鼠的體重，分析體重的整體差異。用多功能小鼠自主活動(dòng)儀記錄小鼠5 min內(nèi)活動(dòng)次數(shù)來評(píng)價(jià)小鼠自主活動(dòng)的能力；避暗穿梭測試儀記錄小鼠5 min內(nèi)避暗穿梭次數(shù)來評(píng)價(jià)小鼠的記憶能力；有機(jī)玻璃穿孔使鼠尾懸掛小鼠掙扎，記錄5 min內(nèi)小鼠因絕望而累計(jì)不動(dòng)的時(shí)間，評(píng)價(jià)絕望程度。水溫20 ℃，小鼠尾系其體重百分之十的鐵塊進(jìn)行力竭游泳時(shí)間記錄，已鼻尖沉入水下10 s為停止記錄時(shí)間，評(píng)價(jià)小鼠疲勞程度。

1.4 He染色

將小鼠頸椎脫臼處死，立即解剖進(jìn)行大體檢查，取小鼠肝、腎、胸腺、脾，摘除好各器官周圍組織，全部標(biāo)本經(jīng)10%福爾馬林固定，低溫修剪組織，在80 %、90 %、95 %、100 %各種濃度乙醇2 h進(jìn)行脫水處理，浸蠟、石蠟包埋，連續(xù)切片機(jī)切成厚度約5 μm的組織切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，干燥，制成HE染色切片，光學(xué)顯微鏡下觀察，照相。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2結(jié)果

2.1亞健康模型一般狀況

表觀上模型組煩躁、易怒、撕咬、皮毛欠光澤、排便??；對(duì)照組行為表現(xiàn)無異常。建模結(jié)束后，將建模鼠40只，剔除病鼠，剩余鼠中隨機(jī)抽取30只做亞健康建模評(píng)價(jià)的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

分組n體重(g)自主活動(dòng)次數(shù)5min(x)避暗穿梭次數(shù)5min(x)5min內(nèi)累計(jì)不動(dòng)(s)力竭時(shí)間(s)對(duì)照組1027.41±1.27213.30±31.41.7±1.5161.00±56.96650.60±198.74模型組1021.20±2.53**111.40±30.2*8.8±2.52**178.40±88.34**254.20±144.28**

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01

從表1看出28 d建模后，模型組小鼠體重低于對(duì)照組，即復(fù)合因素造模影響動(dòng)物的生長發(fā)育和新陳代謝，與亞健康者體重下降表現(xiàn)相似；模型組小鼠5 min內(nèi)自主活動(dòng)量小于對(duì)照組，且表現(xiàn)出精神倦怠，疲勞；模型組小鼠5 min內(nèi)避暗穿梭次數(shù)高于對(duì)照組，即記憶力明顯低于對(duì)照組小鼠，符合亞健康狀態(tài)記憶力降低的情況；絕望測試結(jié)果顯示模型組小鼠5 min內(nèi)呈現(xiàn)間歇性掙扎，掙扎時(shí)間明顯小于對(duì)照組；力竭游泳時(shí)間測試結(jié)果顯示模型組小鼠先沉于水下，體力明顯不如對(duì)照組小鼠。以上結(jié)果均符合亞健康基本特性。

2.2病理學(xué)分析

圖1　肝臟、腎、胸腺、脾HE染色(HE×20x)Fig.1　Mice liver、kidney、thymus、spleen HE staining(HE×20x)注：A為空白對(duì)照組，B為亞健康組。

肝、腎、胸腺和脾臟的病理結(jié)果顯示，復(fù)合因素建立的亞健康模型未對(duì)小鼠各臟器造成器質(zhì)性病變。

3討論

疲勞、活力減退、記憶力降低等為亞健康的主要臨床表現(xiàn)，多由于軀體壓力、社會(huì)壓力、心理壓力等多方面因素共同刺激形成[11]，嚴(yán)重威脅人類的生活。本實(shí)驗(yàn)采用強(qiáng)迫游泳、睡眠剝奪、束縛、夾鼠尾應(yīng)激復(fù)合因素制造的亞健康小鼠模型，通過對(duì)其體重變化、自主活動(dòng)量、避暗穿梭次數(shù)、鼠尾懸掛5 min內(nèi)累計(jì)不動(dòng)時(shí)間、負(fù)重游泳力竭時(shí)間的統(tǒng)計(jì)驗(yàn)證以及肝、腎、胸腺、脾臟病理檢查驗(yàn)證亞健康模型是否建立成功。

食欲不振、腹瀉、消瘦是亞健康癥狀表現(xiàn)之一，從體重的變化來看，模型組小鼠28天建模后體重明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。而慢性疲勞、記憶力降低、精神倦怠是亞健康狀態(tài)最典型的表現(xiàn)，從自主活動(dòng)分析儀分析的數(shù)據(jù)顯示亞健康組小鼠被干預(yù)生物鐘無規(guī)律后，精神倦怠，不愛走動(dòng)，明顯不如正常組活動(dòng)量大(P<0.01)；避暗穿梭儀分析小鼠避暗穿梭的次數(shù)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組小鼠被電擊次數(shù)多，即實(shí)驗(yàn)組小鼠避暗次數(shù)明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，符合記憶力減退這一現(xiàn)象；通過鼠尾懸掛，記錄5 min內(nèi)計(jì)小鼠累不掙扎時(shí)間，即絕望時(shí)間的統(tǒng)計(jì)，實(shí)驗(yàn)組小鼠時(shí)間多于正常組小鼠(P<0.05)，符合心理上的亞健康；從力竭游泳時(shí)間上來看，模型組小鼠先沉于水下，易疲勞，體力明顯不如對(duì)照組小鼠(P<0.05)。亞健康狀態(tài)是介于健康與疾病的邊緣狀態(tài)，是機(jī)體在無器質(zhì)性病變情況下發(fā)生的一些功能性的改變。所以本實(shí)驗(yàn)為排除小鼠主要器官并未發(fā)生病變，將代謝器官肝、腎，免疫器官胸腺、脾，進(jìn)行HE染色觀察，結(jié)果顯示無器質(zhì)病變。

以往單一因素建模如強(qiáng)迫游泳、跑臺(tái)法，僅僅考慮亞健康中軀體疲勞這一現(xiàn)象，且跑臺(tái)容易造成尾部或足部挫傷、出血而引起繼發(fā)感染等癥。本建模方法從心理和軀體共同刺激建模，模擬社會(huì)競爭激烈，應(yīng)激刺激，精神壓力過大以及過度疲勞、缺乏睡眠等綜合成因建立亞健康模型，把握亞健康處于健康與疾病這一邊緣狀態(tài)，時(shí)刻防止亞健康小鼠往病態(tài)小鼠這一狀態(tài)轉(zhuǎn)化。通過表觀觀察以及行為學(xué)儀器多功能自主活動(dòng)分析儀、避暗穿梭測試儀更準(zhǔn)確的測定各組小鼠的差異。在建模期間，注意小鼠的飲食飼養(yǎng)環(huán)境，按時(shí)進(jìn)行消毒，合理設(shè)計(jì)時(shí)間，即從亞健康的成因及癥狀綜合考慮亞健康成因，又不違反《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)法》。

綜上所述，小鼠處于未病與病態(tài)的中間狀態(tài)。即采用復(fù)合因素建立的亞健康模型，小鼠的各項(xiàng)指標(biāo)符合亞健康的特征。說明該造模方法具有一定合理性，為亞健康模型的進(jìn)一步探究和改善亞健康的臨床藥物篩選墊定基礎(chǔ)。

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Composite Factors of Establishing the Subhealthy Mice Model

HAOWenli，CHENZhibao，ZHAORui*，BOLe，ZHANGTenglong

(College of Life Sciences，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319，Heilongjiang，China)

Abstract：Objective: The purpose of this research is to employ Compound factors to construct mice sub-health model which has analogical clinical symptoms to mankind. Methods: Employed force-swimming, sleep deprivation, restraint stress, tail clipping to construct mice sub-health model and assess the effect through the appearance, behavior experiment and pathological examination. Result: The model group has significant difference compared with the control group in aspect of appearance, weight, autonomic activities, step-through test, tail suspension, force-swimming test(P<0.05). But athology examination shows no significant lesion to the model group. Conclusion: The method of compound factors can establish mice sub-health model.

Key words：compound factors; sub-health model；mice

文章編號(hào)：1007-7146(2015)06-0580-04

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

中圖分類號(hào)：R-332

*通訊作者：趙蕊，碩士生導(dǎo)師，副教授，研究方向是中草藥活性成分機(jī)制的研究。(電子郵箱)zhaoruier@sina.com

作者簡介：郝文麗(1989-)，女，漢， 黑龍江大慶，在讀碩士研究生，研究方向是中草藥防治疾病的研究。(電話)18645986033;(電子郵箱)598322851@qq.com；

基金項(xiàng)目：中國博士后科學(xué)基金2014M551281

收稿日期：2014-12-30;修回日期:2015-06-12

doi:10.3969/j.issn.1007-7146.2015.06.015