蒙藥水梔子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究*

★李養(yǎng)學(xué)1,2*通信作者：李養(yǎng)學(xué)，男，碩士。研究方向：中藥新藥研究與質(zhì)量控制。Tel：020-83502098，E-mail：efongzg@126.com。張?jiān)?李素梅1,2胥愛麗1,2江潔怡1,2(1.廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院廣州 510095；2.廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室廣州 510095；3.廣東省食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)校廣州 510663)

摘要：目的: 應(yīng)用現(xiàn)代分析方法，建立蒙藥水梔子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法: 采用薄層色譜法進(jìn)行鑒別；采用HPLC法測(cè)定水梔子中梔子苷的含量，Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5μm)，乙腈-水為(15∶85)流動(dòng)相，柱溫25℃，流速1.0 mL/min，在238nm波長下檢測(cè)。結(jié)果: 薄層色譜斑點(diǎn)清晰，分離度好；含量測(cè)定梔子苷在0.1132～1.132μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(r=0.99996)，平均回收率為100.32%(RSD為1.09%，n=2)。結(jié)論: 所建方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于蒙藥水梔子的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：蒙藥；水梔子；薄層鑒別；高效液相色譜法；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

水梔子為茜草科植物長果梔子GardeniajasminoidesEllisf. Longicarpa Z.W.Xie et Okada的干燥成熟果實(shí)[1-2]，又名大梔子、馬牙梔，蒙藥名稱“朱如拉”[1]，是中藥梔子的一個(gè)變型[3]，始見于《八閩通志》[4]，主要分布于江西、廣西、湖南、四川等地[5]。水梔子味酸、微苦，燉、燥、涼，具有清血熱，明目，祛“巴達(dá)干協(xié)日”，生津，調(diào)元[1]。

現(xiàn)代研究表明，水梔子含有環(huán)烯醚萜類、單萜苷類、二萜類、三萜類、黃酮類、奎寧酸及其衍生物以及倍半萜等成分[6-8]，所含成分具有明顯的鎮(zhèn)痛、抗炎[9-10]、保肝[11]、降血糖[12]、抗血栓[13]等作用。

水梔子作為蒙藥應(yīng)用歷史已較為久遠(yuǎn)，而對(duì)其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)的研究相對(duì)較少。本實(shí)驗(yàn)就水梔子的鑒別和含量測(cè)定等項(xiàng)目進(jìn)行了較為全面和系統(tǒng)的研究，為建立和完善其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1儀器與試藥

1.1儀器薄層自動(dòng)鋪板器(BQ-Ⅱ型，重慶南岸實(shí)驗(yàn)電器廠)；薄層色譜點(diǎn)樣儀(CAMAG 4型，瑞士)、薄層色譜數(shù)碼成像系統(tǒng)(CAMAG Reprostar 3，瑞士)；十萬分之一電子分析天平(Mettler-Toledo XS205DU，瑞士)；超純水機(jī)(MilliPore Advantage A10，美國)；電熱恒溫水浴鍋(HWS-26，上海)；高效液相色譜儀(Agilent 1200，美國)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9203A，上海精宏設(shè)備有限公司)；數(shù)控超聲波清洗器(KQ52300DE，昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2試藥梔子苷由中國食品藥品檢定研究院提供(含量：99.7%，批號(hào)：110749-201115)；水梔子藥材由內(nèi)蒙古大漠藥業(yè)公司提供(批號(hào)：20131101、20131102、20131103、20140201、20140202)，內(nèi)蒙古自治區(qū)藥品檢驗(yàn)所周凱主任中藥師鑒定為茜草科梔子屬植物長果梔子GardeniajasminoidesEillsf.longicarpaZ. W. Xie et Okada的干燥成熟果實(shí)。硅膠GF254薄層板為Merck預(yù)制板；水為自制超純水；乙腈試劑級(jí)別為色譜純；其它實(shí)驗(yàn)試劑級(jí)別為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1薄層色譜的鑒別

2.1.1取水梔子樣品適量，研細(xì)，取粉末約0.1g，加25mL甲醇，超聲30min，溶液進(jìn)行過濾，濾液水浴蒸干，殘?jiān)?mL甲醇使溶解，制得水梔子供試品溶液。照2010年版《中國藥典》一部附錄Ⅵ B薄層色譜法試驗(yàn)，吸取5μL上述溶液，分別于同一Merck硅膠GF254薄層板上點(diǎn)樣，展開劑為：甲苯-甲酸乙酯-甲酸(8∶2∶0.15)，進(jìn)行展開，取出，晾干。繼續(xù)噴以硫酸乙醇溶液(1→10)，并于105℃下加熱，至斑點(diǎn)顯色清晰，置365nm下檢視。供試品色譜中，在色譜相應(yīng)的位置上，顯七個(gè)主要的的熒光斑點(diǎn)。見圖1。

2.1.2取梔子苷對(duì)照品(110749-201115)，制成每1mL含2mg梔子苷的甲醇溶液，作為對(duì)照品溶液。照2010年版《中國藥典》一部附錄Ⅵ B薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述供試品溶液5μL，吸取上述對(duì)照品溶液5μL，分別點(diǎn)于同一Merck硅膠GF254薄層板上，展開劑為：正丁醇-乙酸乙酯-50%氨水(4∶1∶5)經(jīng)放置的上層溶液，進(jìn)行展開，取出，晾干。繼續(xù)噴以香草醛硫酸溶液(5→100)，并于105℃下加熱，至斑點(diǎn)顯色清晰。在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，供試品色譜顯相同顏色的斑點(diǎn)。見圖2。

1.水梔子(20131101)；2.水梔子(20131102)；3.水梔子(20131103)；

4.水梔子(20140201)；5.水梔子(20140201)

圖1五批次水梔子薄層色譜圖

1.梔子苷對(duì)照品； 2.水梔子(20131101)；3.水梔子(20131102)；

4.水梔子(20131103)；5.水梔子(20140201)；6.水梔子(20140201)

圖2水梔子薄層色譜圖

2.2含量測(cè)定[14-16]

2.2.1對(duì)照品溶液制備精密稱取梔子苷對(duì)照品11.36mg(110749-201115)，置于100mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即制得每1mL含梔子苷0.1132mg的照品溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.2.2供試品溶液制備取本品粉末(批號(hào)：20131101，過四號(hào)篩)約0.1g，精密稱定，置具塞三角瓶中(100mL)，精密加入50mL甲醇，密塞，稱重，超聲波清洗器(功率250W，頻率45kHz)超聲處理30min，取出，放冷，再用甲醇將減失的重量補(bǔ)足，搖勻，濾過。取續(xù)濾液，精密量取25mL，置50mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3色譜條件色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18(4.6mm×250mm，5μm)柱；流動(dòng)相：乙腈-水(15∶85)；檢測(cè)波長：238nm；流速：1.0mL/min；柱溫：25℃。見圖3-4。

圖3　梔子苷對(duì)照品HPLC圖譜

圖4　供試品HPLC圖譜

2.2.4線性關(guān)系考察精密量取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液1,2,4,6,8,10mL，分別置于10mL量瓶中，甲醇定容，搖勻，分別制成對(duì)照品溶液，即每1mL分別含梔子苷為11.32,22.64,45.28,67.92,90.56,113.2μg。分別精密吸取10μL，按“2.2.3”項(xiàng)下高效液相色譜測(cè)定條件測(cè)定，以積分峰面積(Y)對(duì)梔子苷的含量(X)進(jìn)行回歸計(jì)算，得梔子苷標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=1015.03968X+2.8811092，r=0.99996。表明梔子苷在0.1132～1.132μg范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.2.5儀器精密度試驗(yàn)精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液(批號(hào)：20131101)10μL，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，按“2.2.3”項(xiàng)下高效液相色譜測(cè)定條件測(cè)定，測(cè)得供試品溶液中梔子苷峰面積積分值RSD為0.31%，表明高效液相色譜儀精密度良好。

2.2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液，于0、2、4、6、8和12h分別進(jìn)樣10μL，按“2.2.3”項(xiàng)下高效液相色譜測(cè)定條件進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得供試品溶液中梔子苷峰面積積分值的RSD為0.33%，表明供試品溶液的穩(wěn)定性在12h內(nèi)良好。

2.2.7重復(fù)性試驗(yàn)取本品粉末(批號(hào)：20131101)，按“2.2.2” 項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備供試品溶液6份，分別精密吸取10μL進(jìn)樣，按“2.2.3”項(xiàng)下高效液相色譜條件進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得峰面積積分值并計(jì)算含量，得梔子苷含量RSD為0.78%，表明本方法重現(xiàn)性較好。

2.2.8加樣回收率試驗(yàn)分別取水梔子樣品粉末(批號(hào)20131101)9份，按回收率試驗(yàn)方法，分別加入一定量梔子苷對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法處理，按“2.2.3”項(xiàng)下高效液相色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算樣品中梔子苷含量，并計(jì)算回收率，結(jié)果平均回收率為100.32%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.09% (n=2)，表明本含量測(cè)定方法可靠、準(zhǔn)確度高，結(jié)果見表1。

表1　梔子苷加樣回收率測(cè)定結(jié)果(n=2)

2.2.9樣品測(cè)定分別取各批次水梔子樣品粉末，按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法處理，按“2.2.3”項(xiàng)下高效液相色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算各批次水梔子樣品中梔子苷的含量，結(jié)果見表2。

表2　各批次樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=2)　mg/g

3討論

3.1蒙藥水梔子含有環(huán)烯醚萜類、單萜苷類、二萜類、三萜類等成分，和中藥梔子成分較為接近。通過對(duì)水梔子藥材環(huán)烯醚萜類成分進(jìn)行薄層色譜鑒別研究，建立了水梔子藥材中環(huán)烯醚萜類成分薄層色譜鑒別方法，同時(shí)對(duì)前文所述鑒別方法進(jìn)行了方法學(xué)考察(分別對(duì)不同溫度、不同濕度及不同廠家的薄層板進(jìn)行了比較)，結(jié)果表明該鑒別方法對(duì)不同溫度及不同濕度的適應(yīng)性較好，色譜圖Rf值適中，且色譜斑點(diǎn)較為豐富、清晰，分離度較好。

3.2水梔子中所含梔子苷為中藥活性成分，故選擇梔子苷作為控制其質(zhì)量的指標(biāo)成分。參考《中國藥典》及相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)水梔子進(jìn)行了含量測(cè)定，對(duì)方法中流動(dòng)相及流動(dòng)相的比例、柱溫、流速、提取溶劑、提取方式、提取時(shí)間以及含量測(cè)定方法的方法學(xué)等進(jìn)行了考察?？疾旖Y(jié)果表明，該含量測(cè)定方法簡(jiǎn)便、重現(xiàn)性好、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，可用于對(duì)水梔子樣品的質(zhì)量控制。

3.3為了全面的了解和控制蒙藥水梔子的質(zhì)量，更好的為蒙醫(yī)用藥服務(wù)，還當(dāng)進(jìn)一步收集更多產(chǎn)地及批次的樣品進(jìn)行歸類研究。

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(收稿日期：2015-09-05)編輯：曾文雪

中圖分類號(hào)：R282

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

*基金項(xiàng)目：廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2012A030100017)。