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        澳洲茄堿和澳洲茄胺抑制肺癌細(xì)胞的構(gòu)效比較*

        2015-03-08 06:23:51陳來(lái),郭權(quán),金德忠
        江西中醫(yī)藥 2015年12期
        關(guān)鍵詞:肺癌

        澳洲茄堿和澳洲茄胺抑制肺癌細(xì)胞的構(gòu)效比較*

        ★陳來(lái)1*第一作者:陳來(lái)(1976—),男,講師,博士。研究方向:生物醫(yī)藥。E-mail:385907358@qq.com。郭權(quán)1金德忠1,2張潔1李?yuàn)檴?黃云1羅小泉1(1.江西中醫(yī)藥大學(xué)南昌 330004;2.南昌大學(xué)南昌 330000)

        摘要:目的:探討澳洲茄堿及其水解苷元澳洲茄胺對(duì)肺癌細(xì)胞抑制的構(gòu)效關(guān)系。方法:MTT法檢測(cè)澳洲茄堿及澳洲茄胺對(duì)A549和LLC細(xì)胞抑制作用;以20μg/mL的澳洲茄堿和8μg/mL澳洲茄胺分別處理A549細(xì)胞24h,觀察細(xì)胞形態(tài),并經(jīng)定量PCR檢測(cè)p53靶基因Bax和Puma表達(dá)水平。結(jié)果:對(duì)A549和LLC細(xì)胞,澳洲茄胺的24h IC50大約都為7.5μg/mL,澳洲茄堿的大約都為19μg/mL。形態(tài)學(xué)觀察表明澳洲茄胺和澳洲茄堿處理的A549細(xì)胞都呈現(xiàn)細(xì)胞膜皺縮的垂死形態(tài)。定量PCR數(shù)據(jù)顯示,與溶媒相比澳洲茄堿及澳洲茄胺都顯著提高了p53通路Puma基因表達(dá)水平(P<0.001和P<0.05)。結(jié)論:澳洲茄堿及澳洲茄胺對(duì)癌細(xì)胞抑制量效模式相同,有效部位是苷元,作用機(jī)制是誘導(dǎo)細(xì)胞死亡,分子機(jī)制可能是通過(guò)上調(diào)Puma表達(dá)而激活p53信號(hào)通路。

        關(guān)鍵詞:澳洲茄堿;澳洲茄胺;肺癌;構(gòu)效

        龍葵全草均可入藥,其生物活性成分主要包括甾體類(lèi)生物堿、多糖、維生素A和維生素C等;其中,甾體類(lèi)生物堿具有抗腫瘤活性[1];又以澳洲茄堿能以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和/或壞死的方式顯著抑制肺癌細(xì)胞[2]等腫瘤的生長(zhǎng),但其起作用的主要有效基團(tuán)及其分子機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。澳洲茄堿的水解苷元是澳洲茄胺[3]。本課題從半致死劑量、細(xì)胞形態(tài)和p53信號(hào)通路[4]的影響等方面比較澳洲茄堿與澳洲茄胺對(duì)相同肺癌細(xì)胞的抑制作用,以探討前體及其水解苷元之間的構(gòu)效關(guān)系,從而揭示澳洲茄堿和澳洲茄胺抑制肺癌細(xì)胞的主要基團(tuán)及其分子機(jī)制。

        1材料與儀器

        1.1試劑與儀器鏈霉素、青霉素、MTT粉末、胰蛋白酶、多聚賴(lài)氨酸均購(gòu)自Sigma公司,DMEM購(gòu)自Hyclone公司,胎牛血清購(gòu)自GIBCO公司,10cm、6cm培養(yǎng)皿、96孔板購(gòu)自NORMAX公司;BINDER CO2培養(yǎng)箱,Nikon ECLIPSE TS100倒置光學(xué)顯微鏡,VARIOSKAN FLASH酶標(biāo)儀(Thermo SCIENTIFIC公司),超聲波細(xì)胞破碎儀(JY92-II型號(hào),南京先敏儀器制造有限公司),Roche反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Roche),LightCycler?96 SW 1.1序列檢測(cè)系統(tǒng)(Roche)。

        澳洲茄胺、澳洲茄堿的提取與純化方法參考文獻(xiàn)[3],最終獲得HPLC級(jí)濃度分別為94.5%和97.5%的粉末。

        1.2細(xì)胞人類(lèi)肺癌A549、小鼠Lewis肺癌LLC細(xì)胞株由南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所劉耕老師實(shí)驗(yàn)室提供。細(xì)胞以含10%FBS及1萬(wàn)單位/mL雙抗的DMEM全培養(yǎng)基培養(yǎng)于0.5%CO2、37℃及90%左右濕度的CO2培養(yǎng)箱中。

        1.3藥物溶液的制備

        1.3.1澳洲茄堿的均一溶液的制備參考文獻(xiàn)[3]。稱(chēng)取50mg用DMSO溶解成濃度為44.5mg/mL的均一溶液,置于4℃冰箱避光保存、備用。

        1.3.2均一澳洲茄胺醇溶液的制備。稱(chēng)取20mg澳洲茄胺加入5mL無(wú)水乙醇,用超聲波以最大功率的17%(300瓦)超聲處理1s、停2s,共處理2.8min,混懸液變得均一,但仍有肉眼勉強(qiáng)可視的顆粒,再加入5mL無(wú)水乙醇,經(jīng)振蕩處理2min后顆粒完全溶解,從而獲得濃度為2000μg/mL的均一醇溶液,置于4℃冰箱避光保存、備用。

        J.澳洲茄堿,a.澳洲茄胺

        2方法與結(jié)果

        2.1MTT法檢測(cè)和比較澳洲茄胺和澳洲茄堿對(duì)肺癌細(xì)胞的抑制作用細(xì)胞以2000個(gè)/孔鋪至96孔板內(nèi),空白對(duì)照、加溶媒組、加藥組(澳洲茄胺從0.625、1.25、2.5、5、10到20μg/mL;澳洲茄堿從5、10、20、40、60到80μg/mL,共6個(gè)梯度)各重復(fù)5個(gè)孔,共2~3板。以100μLDMEM全培養(yǎng)基培養(yǎng)20小時(shí)后,分別換成200μL空白、含溶媒或各濃度澳洲茄胺和澳洲茄堿的DMEM全培養(yǎng)基,24、48、72h后各取一96孔板,吸去培養(yǎng)基并加入200μL含5mg/mL MTT(溶于1×PBS并過(guò)濾)的新鮮DMEM全培養(yǎng)基,CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h。小心吸去培養(yǎng)液,加入150μLDMSO搖床搖5min,用酶標(biāo)儀振蕩20s后測(cè)各孔OD492的值。每板細(xì)胞中同一細(xì)胞的各濃度藥物的抑瘤率按下面公式計(jì)算:

        抑瘤率=1-(藥物組OD492-空白組OD492)/(溶媒組OD492-空白組OD492)×100%

        結(jié)果見(jiàn)圖1。從結(jié)果來(lái)看,基本上澳洲茄胺和澳洲茄堿對(duì)兩種惡性肺癌細(xì)胞的抑制呈現(xiàn)與濃度成正相關(guān)的趨勢(shì),并可以容易得出澳洲茄胺對(duì)A549、LLC細(xì)胞處理24h的IC50分別皆為約7.5μg/mL;而澳洲茄堿對(duì)A549和LLC細(xì)胞處理24h的IC50均約為19μg/mL。

        2.2細(xì)胞形態(tài)觀察比較實(shí)驗(yàn)過(guò)程參考文獻(xiàn)[2]。A549細(xì)胞以0.8×106/皿的密度鋪到6cm培養(yǎng)皿中,DMEM全培養(yǎng)基培養(yǎng)20h后,再加入澳洲茄胺(用DMEM全培養(yǎng)基稀釋至終濃度為8μg/mL)及其溶媒無(wú)水乙醇(終濃度為0.4%v/v),或澳洲茄堿(用DMEM全培養(yǎng)基稀釋至終濃度為20μg/mL)及其溶媒DMSO(終濃度為0.045%v/v)處理24h細(xì)胞,用Nikon倒置顯微鏡,明場(chǎng)40×10倍觀察細(xì)胞形態(tài)并攝像稍高于半致死劑量的澳洲茄胺處理過(guò)的肺癌細(xì)胞呈現(xiàn)細(xì)胞膜皺縮的垂死形態(tài),而無(wú)水乙醇處理的細(xì)胞則形態(tài)飽滿(mǎn)、細(xì)胞膜完整、圓潤(rùn)。澳洲茄堿及其溶媒處理的細(xì)胞也觀察到分別與澳洲茄胺及其溶媒處理細(xì)胞相同的情形及文獻(xiàn)[2],結(jié)果見(jiàn)圖2。

        圖28μg/mL澳洲茄胺及乙醇,或20μg/mL澳洲茄堿及DMSO處理24h后的A549細(xì)胞形態(tài)比較,比例尺:200μm。

        圖38μg/mL澳洲茄胺及乙醇,或20μg/mL澳洲茄堿及DMSO處理24h后的A549細(xì)胞中p53通路下游各基因表達(dá)情況比較。*P<0.05,有顯著性差異;***P<0.001,有極顯著性差異;N.S:P≥0.05,無(wú)顯著性差異。

        3構(gòu)效分析與討論

        比較澳洲茄胺與澳洲茄堿對(duì)相同的兩種肺癌細(xì)胞的抑制效果,可以看到,兩種藥物對(duì)同一種肺癌細(xì)胞的抑制效果不管從時(shí)間依賴(lài)還是從濃度依賴(lài)來(lái)看,走勢(shì)都很接近,提示這兩種藥物對(duì)同種肺癌細(xì)胞存在相似作用模式,這一點(diǎn)可以從藥物作用后的細(xì)胞形態(tài)變化(圖2)和激活相同的信號(hào)通路(圖3)獲得支持;而兩種藥物的IC50值則分別為7.5μg/mL左右和19μg/mL左右,后者將為前者的2.5倍多一點(diǎn)。比較澳洲茄堿和澳洲茄胺的分子結(jié)構(gòu),可以看到,澳洲茄胺只是澳洲茄堿的苷元部分[3],這就表明,澳洲茄胺和澳洲茄堿起相同抑制腫瘤生長(zhǎng)效果的分子基團(tuán)應(yīng)該就是它們共有的苷元部分,而且前者效果是后者的兩倍還多??紤]到澳洲茄胺的分子量為413.62,而澳洲茄堿的分子量為884.06,后者是前者的2倍多,這就說(shuō)明澳洲茄堿水解成澳洲茄胺之后,相同質(zhì)量的兩種藥物分子中有效苷元成分后者是前者的2.1倍多,再考慮到兩者純度上的差異(后者為94.5%,前者為97.5%),這就與澳洲茄胺抑制肺癌細(xì)胞的IC50值是澳洲茄堿的約2.5倍相一致,因此,從分子量的比較來(lái)看,也驗(yàn)證了苷元部分是澳洲茄胺和澳洲茄堿抑制肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的有效分子基團(tuán)這一推論,不難理解,澳洲茄堿結(jié)構(gòu)中的非苷元部分在對(duì)肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)并不起主要的作用。因此,澳洲茄堿的水解釋放苷元提高了抑制腫瘤細(xì)胞的藥效。肺癌是目前危害世界人民的最大惡性腫瘤之一[6-7],而且還尚未找到有效的治療藥物[8]。我們的研究結(jié)果表明龍葵提取物澳洲茄堿的水解苷元澳洲茄胺能更有效地抑制肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng),從而為緩解和治療腫瘤病患又提供了新的潛在的藥物選擇。

        參考文獻(xiàn)

        [1]曹熙敏,范翠麗.野生龍葵的開(kāi)發(fā)利用研究進(jìn)展[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),2011(3):40-42.

        [2]陳來(lái),李?yuàn)檴?,金德忠,?中藥龍葵提取物澳洲茄堿對(duì)肺癌細(xì)胞抑制作用[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2015,26(2):333-334.

        [3]羅習(xí)珍,陳來(lái),劉建軍,等.高效液相色譜法測(cè)定龍葵中的澳洲茄胺[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2009,20(2):273-274.

        [4]陳來(lái),李?yuàn)檴?,羅小泉,等.p53抑癌功能的研究進(jìn)展[J].江西中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2014,26(4):93-96.

        [5]陳來(lái),胡珺,李?yuàn)檴櫍?澳洲茄堿對(duì)黑色素瘤細(xì)胞的抑制作用[J].江西中醫(yī)藥,2014,45(12):29-30.

        [6]錢(qián)桂生,余時(shí)滄.肺癌流行病學(xué)最新資料與啟示[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,2012,35(2):86-89.

        [7]昌盛,代敏,任建松,等.中國(guó)2008年肺癌發(fā)病、死亡和患病情況的估計(jì)及預(yù)測(cè)[J].中華流行病學(xué)雜志,2012,33(4):391-394.

        [8]楊拴盈.肺癌早期診斷的現(xiàn)狀、困惑和希望[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2011,32(1):1-5.

        (收稿日期:2015-11-27)編輯:翟興英

        中圖分類(lèi)號(hào):R285

        文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:B

        *基金項(xiàng)目:江西中醫(yī)藥大學(xué)博士啟動(dòng)基金項(xiàng)目(2014BS004);江西省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)教育計(jì)劃項(xiàng)目(2014);江西省衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科研計(jì)劃項(xiàng)目(2013A072)。

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