杏香兔耳風(fēng)中5種單體對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞內(nèi)NO生成的影響*

★謝斌1*第一作者:謝斌(1975—),男,副教授。研究方向:中醫(yī)藥抗感染。E-mail：331080826@qq.com。吳蓓2歐陽(yáng)輝1黎田兒1李艷1張武崗1楊世林1馮育林1*通信作者:馮育林，男，教授。研究方向:中藥化學(xué)成分。E-mail:fengyulin2003@hotmail.com。(1.江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥固體制劑制造技術(shù)國(guó)家工程研究中心南昌 330006；2.南昌市食品藥品檢驗(yàn)所南昌 330038)

摘要：目的：觀察從杏香兔耳風(fēng)中分離得到的木犀草素、木犀草苷、綠原酸、3，5-二咖啡?；鼘幩?3，5-DCQA)和4，5-二咖啡?；鼘幩?4,5-DCQA)5種中藥單體對(duì)LPS誘導(dǎo)的炎癥狀態(tài)中細(xì)胞內(nèi)NO含量的影響，從而初步篩選出具有抗炎作用的中藥單體。方法：以LPS誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞建立炎癥反應(yīng)模型，采用木犀草素等5種不同中藥單體預(yù)處理細(xì)胞，另設(shè)正常對(duì)照組及LPS單獨(dú)處理組，采用Griess試劑法分別測(cè)定各組NO生成含量。結(jié)果：5種單體均能降低LPS誘導(dǎo)的炎癥狀態(tài)下RAW264.7細(xì)胞內(nèi)NO的生成，且與各單體的濃度相關(guān)。結(jié)論：杏香兔耳風(fēng)中5種單體可明顯降低LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NO的含量從而發(fā)揮抗炎作用。

關(guān)鍵詞：杏香兔耳風(fēng)；5種單體；NO；炎癥

炎癥是十分常見(jiàn)而又重要的基本病理過(guò)程。炎癥不同于感染，但很多炎癥又是基于感染而發(fā)生的。在臨床治療上，抗炎藥物也是僅次于抗感染藥物的第二大類藥物。許多傳統(tǒng)中藥都有顯著的抗炎作用，從中分離得到的中藥單體也具有很好的抗炎作用[1-2]。中藥單體成分簡(jiǎn)單，作用機(jī)制及其毒副作用易明確等優(yōu)點(diǎn)，使得開(kāi)發(fā)安全有效的中藥制劑成為治療炎癥的研究熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)LPS誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞建立炎癥反應(yīng)模型[3]，觀察從杏香兔耳風(fēng)中分離得到的木犀草素、木犀草苷、綠原酸、3，5-二咖啡?；鼘幩?3，5-DCQA)和4，5-二咖啡?；鼘幩?4，5-DCQA)五種中藥單體對(duì)LPS誘導(dǎo)的炎癥狀態(tài)中細(xì)胞內(nèi)NO含量的影響，以期初步篩選出具有抗炎作用的中藥單體。

1材料與方法

1.1藥品與試劑五種中藥單體木犀草甘、木犀草素、綠原酸、3，5-二咖啡酰基奎寧酸、4，5-二咖啡?；鼘幩峋杀緦?shí)驗(yàn)室自制，純度大于98%。Griess試劑由上海碧云天生物科技有限公司提供，貨號(hào)為S0021。RPMI1640購(gòu)自Hyclone公司，貨號(hào)為SH30809。FBS購(gòu)自BinInd公司，貨號(hào)為04-001-EA。

1.2主要儀器CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Scientific 8000)，低速離心機(jī)(上海盧湘儀TDZ4B-WS)，分光光度計(jì)(BIO-RAD SmartSpench plus)，倒置顯微鏡(Olympus IX71)。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)及處理RAW264.7小鼠單核/巨噬細(xì)胞系由本實(shí)驗(yàn)室提供，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育。于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入200μL細(xì)胞懸液，2×104個(gè)細(xì)胞/孔，將培養(yǎng)板置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h。分別加入2，4，6mg/mL LPS 100μL，再于每個(gè)濃度的LPS中分別加入不同濃度的五種單體，每個(gè)單體設(shè)4個(gè)濃度(100，200，400，800μg/mL)，每個(gè)濃度設(shè)3給平行孔，另設(shè)正常對(duì)照孔。加藥后，培養(yǎng)板于微孔板振蕩器上振蕩混勻，置于37℃CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h。

1.4NO含量檢測(cè)吸取培養(yǎng)液上清，根據(jù)Geriss說(shuō)明書進(jìn)行NO含量檢測(cè)，用分光光度計(jì)于540nm處測(cè)定吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中NO含量。

2結(jié)果

2.12 mg/mL LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞NO生成的影響表1結(jié)果顯示，正常RAW264.7細(xì)胞內(nèi)NO生成很低，當(dāng)加入LPS誘導(dǎo)后，RAW264.7細(xì)胞內(nèi)NO的生成顯著增加(P<0.01)。經(jīng)LPS處理后分別給予五種單體，檢測(cè)其NO含量，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明加入單體后細(xì)胞內(nèi)NO含量顯著降低(P<0.01)，但多數(shù)仍高于正常對(duì)照組(P<0.01)。表明這五種單體在一定程度上能夠部分抑制LPS誘導(dǎo)的NO生成，且在本實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，各單體濃度越大，NO含量越低。此外，當(dāng)單體濃度增加為800μg/mL時(shí)，綠原酸和3，5-二咖啡?；鼘幩崽幚淼募?xì)胞內(nèi)NO含量低于正常組，推測(cè)隨著單體濃度的增大，NO含量可能低于正常細(xì)胞內(nèi)NO的含量。表明這五種單體能夠部分甚至完全抑制炎癥狀態(tài)下單核/巨噬細(xì)胞內(nèi)NO的生成，且該抑制作用與其濃度有關(guān)。

2.24 mg/mL LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞NO生成的影響由表1結(jié)果可知，當(dāng)LPS為2 mg/mL時(shí)，木犀草素等五種單體能夠降低NO的生成，那么我們考慮當(dāng)增加LPS的濃度時(shí)，這五種單體與NO的關(guān)系又是如何？實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，當(dāng)LPS的濃度上升為4 mg/mL時(shí)，細(xì)胞內(nèi)NO的生成也隨之相應(yīng)上升，較正常組有顯著性差異(P<0.01)。同樣，經(jīng)LPS處理后分別加入五種單體，從表中可以看出細(xì)胞內(nèi)NO的生成減少，且單體濃度越大，NO含量越低(P<0.01)。除800 μg/mL的3，5-DCQA組細(xì)胞內(nèi)NO含量降至正常外，其余均高于正常組。表明當(dāng)LPS濃度增大時(shí)，木犀草素等5種單體同樣能部分甚至完全抑制細(xì)胞內(nèi)NO的生成，且單體濃度越大抑制作用越強(qiáng)。

2.36 mg/ml LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞NO生成的影響為了進(jìn)一步驗(yàn)證以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們將LPS的濃度增加為6mg/mL，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述一致。如表3數(shù)據(jù)所示，當(dāng)LPS濃度上升為6mg/mL時(shí)，RAW264.7細(xì)胞內(nèi)NO生成顯著增加(P<0.01)。同樣，在LPS處理后給予五種單體也能降低細(xì)胞內(nèi)NO的生成，但仍顯著高于正常水平(P<0.01)。此外，從表中還可以看出單體濃度越大，NO含量越低。表明在高濃度的LPS誘導(dǎo)的炎癥狀態(tài)下，木犀

表1　2 mg/mL LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞NO生成的影響

注:與正常對(duì)照組比較，*P<0.01;與單獨(dú)LPS組比較，#P<0.01。

表2　4 mg/mL LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞NO生成的影響

注:與正常對(duì)照組比較，*P<0.01;與單獨(dú)LPS組比較，#P<0.01。

表3　6mg/mL LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞NO生成的影響

草素等五種單體能部分但不能完全抑制NO的生成。

以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，當(dāng)LPS濃度為2mg/mL、4mg/mL或6mg/mL時(shí)，木犀草素、木犀草苷、綠原酸、3，5-DCQA和4，5-DCQA都能呈濃度依賴的抑制LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞內(nèi)NO的生成。表明這五種單體具有一定程度的抗炎作用。

3討論

NO是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因子，可殺滅侵入機(jī)體的病原微生物，維持機(jī)體正常的免疫防御功能。各種動(dòng)物組織和細(xì)胞內(nèi)NO的合成均由一氧化氮合成酶(NOS)催化L-精氨酸形成。NOS有三種亞型，其中誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(iNOS)是合成NO的唯一途徑。少量的NO是維持正常細(xì)胞功能必不可少的物質(zhì)，然而研究表明LPS和/或細(xì)胞因子等刺激因子能誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞高表達(dá)iNOS從而合成過(guò)量的NO，造成細(xì)胞毒性和組織損傷等一系列炎癥反應(yīng)[5-7]。LPS是格蘭陰性菌致病的主要因素，能通過(guò)與細(xì)胞膜受體相互作用，作用于宿主細(xì)胞，并通過(guò)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞級(jí)聯(lián)基因表達(dá)發(fā)生變化[4]。LPS能夠刺激體內(nèi)多種細(xì)胞合成和釋放眾多內(nèi)源性生物活性因子，如NO、PGE2、TNF-a、IL-6等，導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)發(fā)生。

本實(shí)驗(yàn)選取了五種中藥單體檢測(cè)其抗炎活性，分別是木犀草素、木犀草苷、綠原酸、3，5-DCQA和4，5-DCQA。其中木犀草素和木犀草苷均屬黃酮類化合物，是天然黃酮的代表性物質(zhì)。木犀草素具有抗腫瘤、保護(hù)心血管、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)和抗炎等多種藥理學(xué)作用[8-11]。木犀草苷，又名木犀草素-7-O-葡萄糖苷，木犀草苷也是重要的生物活性物質(zhì)，具有抗腫瘤、抗氧化、消炎和抗病毒等多種活性[12-14]。綠原酸是植物體在有氧呼吸過(guò)程中合成的一種苯丙類物質(zhì)，也具有抗菌消炎、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗腫瘤等多種藥理學(xué)功能[15-16]。而3，5-DCQA和4，5-DCQA的活性目前尚不清楚。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)LPS誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞建立細(xì)胞炎癥反應(yīng)模型，檢測(cè)木犀草素等五種單體的抗炎作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，木犀草素、木犀草苷、綠原酸、3，5-DCQA和4，5-DCQA這五種單體均能降低LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞內(nèi)NO的含量。且單體濃度越大，NO的含量越低。表明這五種單體均具有抗炎作用。另外實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明這五種中藥單體之間除個(gè)別外均具有顯著性差異(P<0.05)，但尚不能表明這五種單體有優(yōu)劣之分。這些中藥單體有望成為在NO介導(dǎo)的相關(guān)疾病中發(fā)揮抗炎作用。

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(收稿日期：2015-10-14)編輯：翟興英

中圖分類號(hào)：R285

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

*基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81560636，81102787)；江西省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(20133ACB21005)。