王　洋，蘆曉帆，李杭潔，吳兆寰,李　亞，宋曉琳　(.河南中醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450008；.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 00000；.河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450000)

大鼠連續(xù)尾靜脈采血方法研究

王洋1，蘆曉帆2，李杭潔1，吳兆寰1,李亞3，宋曉琳1(1.河南中醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450008；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100000；3.河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450000)

[摘要]目的采用自制的固定器控制SD大鼠，并用改進(jìn)的采血方法對其尾靜脈進(jìn)行連續(xù)采血,根據(jù)相關(guān)指標(biāo)評價(jià)其效果。方法SD大鼠24只在乙醚麻醉下，采用改進(jìn)的一次性靜脈輸液針進(jìn)行尾靜脈采血并補(bǔ)充生理鹽水，每日1次，連續(xù)13 d。觀察采血成功率和大鼠存活率。結(jié)果24只SD大鼠連續(xù)12 d采血成功；1只SD大鼠在第13天死亡，原因?yàn)橐颐崖樽磉^量，只采到該只大鼠0.2 mL血液。采血成功率為99.68%，SD大鼠存活率為95.83%。結(jié)論使用改良后的一次性靜脈輸液針，實(shí)施SD大鼠尾靜脈采血并補(bǔ)充生理鹽水的方法安全有效、靈活方便，適用于連續(xù)時(shí)間點(diǎn)采集SD大鼠靜脈血的實(shí)驗(yàn)研究。

[關(guān)鍵詞]SD大鼠；連續(xù)；尾靜脈；采血

靜脈采血是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的常用技術(shù)手段，不僅為動(dòng)物血液學(xué)指標(biāo)的測定收集標(biāo)本,而且也為其血清細(xì)胞因子的分析提供原料,同時(shí)也能為血液淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞的分離培養(yǎng)創(chuàng)造基礎(chǔ)。然而，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的血液采集絕非易事，尤其是需要多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的大鼠采血，多次、重復(fù)、連續(xù)采血不易操作，容易導(dǎo)致動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的失敗。這時(shí)就需要一種科學(xué)有效的采血方法，以往常用的靜脈采血方式有眼眶后靜脈采血法、頸靜脈采血法、尾尖采血方法等，這些方法很難滿足連續(xù)時(shí)間點(diǎn)的大鼠血液采集。本文在現(xiàn)有大鼠尾靜脈采血方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)創(chuàng)新，以SD大鼠為對象，進(jìn)行了連續(xù)13 d的尾靜脈采血和補(bǔ)充生理鹽水，取得一定的經(jīng)驗(yàn)與效果，現(xiàn)報(bào)告如下。

1材料與方法

1.1材料

SPF級SD雌性大鼠24只，3月齡，體質(zhì)量(200±20) g，購于河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[合格證號：SCXK(豫)2005-0001]。用滅菌的飼料和去離子水飼養(yǎng)于河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)IVC實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房內(nèi)。75%酒精、無水乙醚、0.9%氯化鈉溶液、1.5 mL離心管、醫(yī)用棉簽、無菌橡膠手套。

1.2固定器的制作

取容量為500 mL，圓柱形且透明的礦泉水瓶制作簡易的固定器。首先將商標(biāo)剪下，打開瓶蓋清洗干凈后用75%酒精擦拭整個(gè)瓶體，自然風(fēng)干。其次在最底部沿透明礦泉水瓶橫斷面將瓶底環(huán)狀剪下，瓶底邊緣處剪1個(gè)直徑為2 cm的鼠尾洞口以便鼠尾露出，然后用橡皮筋將瓶底部和瓶身部再次連接(連接點(diǎn)一般選洞口對應(yīng)的位置)。再次用透明膠帶將修剪好的透明礦泉水瓶，整體固定在長30 cm、寬20 cm的光滑塑料板上，固定時(shí)保證連接點(diǎn)在上而鼠尾洞口在下，兩處連線最好與木板垂直，最后將瓶蓋擰下套半截礦泉水瓶或燒杯，周圍用保鮮膜封嚴(yán)備用。要求布置恰當(dāng)(瓶尾部盡量靠近邊緣，以便鼠尾垂下靜脈充盈)、固定牢固(左右扭轉(zhuǎn)無大幅度晃動(dòng)，以延長固定器的壽命)、粘合緊密(瓶身與塑料板連接處均有透明膠帶粘附且無漏，防止大鼠排泄物或藥物進(jìn)入縫隙，難于清理消毒)。使用前要求用75%酒精消毒以防交叉污染(圖1a)。

1.3靜脈采血針的制作

取5.5號一次性無菌靜脈輸液針。首先將靜脈輸液針(江蘇康進(jìn)醫(yī)療器材有限公司，批號20140425)的軟管從針柄連接部取下(注意不能損壞原有零部件，否則棄用)，去掉前可以先扭轉(zhuǎn)幾下，見連接處滑脫松動(dòng)，快速拉開。取下軟管后，剪掉多余部分，留下7 cm左右軟管(注意保留有針?biāo)ㄟB接的部分)，重新接到針柄尾部。因?yàn)榇饲败浌芤延兴蓜?dòng)，所以連接后一手捏緊連接處，另一手用力牽拉軟管，以便軟管緊密結(jié)合，保證連接處密封不漏。最后將一個(gè)1 mL注射器連接到剪切改裝而成的靜脈采血針的針?biāo)ㄉ?，待?圖1b)。

a:簡易固定器;b:改裝后大鼠尾靜脈采血針

1.4操作方法

首先用75%酒精消毒制作好的大鼠簡易固定器，待其自然揮發(fā)。利用SD大鼠喜好溜邊鉆洞的習(xí)性，抓起鼠尾讓其快速鉆入瓶中，順勢扣緊瓶底只留鼠尾在外。固定好大鼠后，向瓶口燒杯中注入1 mL無水乙醚，30 s左右大鼠進(jìn)入麻醉狀態(tài)。此時(shí)，將大鼠尾部進(jìn)行數(shù)次揉搓，使大鼠血管充分充盈，同時(shí)用75%酒精棉簽進(jìn)行消毒并去除外部鱗狀角質(zhì)層，充分暴露大鼠尾靜脈血管，便于穿刺和快速獲取血液。其次，選擇尾部后1/2～1/3段靜脈血管[1]，作為采血部位(應(yīng)由遠(yuǎn)端開始，以免皮下出血影響持續(xù)采血)。操作者帶一次性無菌手套，左手食、中指稍用力夾持SD大鼠尾靜脈使血管充盈，同時(shí)拇指與無名指捏住鼠尾遠(yuǎn)心端(注意不能食、中指處在同一條靜脈上，以免影響后續(xù)抽血)，使鼠尾繃直無扭轉(zhuǎn)彎曲。右手持針頭，并保持15°左右夾角 ，快速刺入血管，此時(shí)可有明顯的“落空感”或?qū)⑨橆^沿血管循行方向輕輕送入，突然阻力消失，同時(shí)軟管內(nèi)有少量血液露出，表明穿刺成功。此時(shí)，右手輕輕抽吸注射器，軟管里有血液流出，即可繼續(xù)緩慢抽吸注射器進(jìn)行采血。若中途血液量少或消失，可左右微微調(diào)整針頭或旋轉(zhuǎn)針頭，見血液流出方可繼續(xù)采血。若血管癟陷，則需稍壓近心端，也可自上而下輕捋鼠尾，待其充盈后再采集。每只大鼠每天采集0.6 mL的血液與1.5 mL離心管內(nèi)，采集完后回折軟管，去掉采集有血液的注射器，更換上抽好0.6 mL生理鹽水的注射器，緩緩進(jìn)行注射(圖2)。

1.5操作后護(hù)理

每只大鼠采血結(jié)束后均用75%酒精消毒，防止傷口感染，并用醫(yī)用棉簽按壓針孔數(shù)秒止血。待大鼠蘇醒后注意觀察有無異常，無異常的放回籠中；若有異常，注意監(jiān)視。

a：固定大鼠于固定器中，充分暴露鼠尾；b：在前端燒杯中注入無水乙醚對大鼠進(jìn)行麻醉；c：75%酒精棉簽或棉球進(jìn)行大鼠尾部消毒并去除外層鱗狀角質(zhì)層；d：用改裝后的注射器進(jìn)行尾靜脈采血；e：尾靜脈注射生理鹽水補(bǔ)液

圖2采血流程圖

1.6觀察指標(biāo)

每只大鼠每天成功抽取0.6 mL記為成功采血1次，記錄每天采血次數(shù)。每天取血后觀察大鼠的情況和大鼠的死亡數(shù)量，最后計(jì)算采血成功率以及大鼠存活率。

2結(jié)果

連續(xù)時(shí)間段的前12 d內(nèi)，24只大鼠均穿刺成功，總采血次數(shù)為311次，采血總量達(dá)到172.8 mL。第13天時(shí)，1只SD大鼠因麻醉過量，采血到0.2 mL時(shí)死亡。采血成功率為99.68%，大鼠存活率為95.83%。

3討論

SD大鼠為美國Sprague Dawley農(nóng)場用Wistar大鼠培育而成，被較多科學(xué)研究選用。實(shí)驗(yàn)中用SPF級SD大鼠，飼養(yǎng)于屏障動(dòng)物房中，很大程度上避免了血液學(xué)指標(biāo)的差異。其具有生長發(fā)育較快、個(gè)體較大的特點(diǎn)，但清醒狀態(tài)下性情較Wistar大鼠兇猛，不易控制。 所以實(shí)驗(yàn)操作時(shí)，固定大鼠顯得尤為重要。本實(shí)驗(yàn)受到施文等[2]使用廢棄50 mL離心管的啟發(fā)，采用透明礦泉水瓶固定，其來源廣泛、價(jià)格低廉，實(shí)驗(yàn)中便于觀察大鼠的生命體征，實(shí)驗(yàn)后便于清洗、消毒。其小巧輕便，制作簡單，不失為簡、便、廉、效的固定方法。袁林祥等[3]采用棕色的瓶子則無方便觀察的優(yōu)點(diǎn)。另外，簡易固定器的前端安置燒杯，便于乙醚注射，固定和麻醉于一體，極大縮減操作流程。

然而，在清醒狀態(tài)下，直接用注射器尾靜脈采血，大鼠尾部受到刺激時(shí)也容易出現(xiàn)縮進(jìn)固定器內(nèi)或者體位變動(dòng)的情況，從而造成跑針，導(dǎo)致采血失敗。若采血后進(jìn)行藥物干預(yù)，則需要再次穿刺才能進(jìn)行。反復(fù)多次穿刺大鼠尾靜脈，或者多個(gè)時(shí)間點(diǎn)連續(xù)采血還可造成大鼠尾部創(chuàng)傷較多，特別是尾靜脈刺穿之后未能妥善止血，將會(huì)造成皮下淤青，導(dǎo)致后期無法繼續(xù)采血或者影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，甚至大鼠死亡。同時(shí)在大鼠清醒狀態(tài)下，其應(yīng)激反應(yīng)強(qiáng)烈，極有可能對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生背景性干擾[4]。因此，本實(shí)驗(yàn)對大鼠進(jìn)行乙醚麻醉。乙醚為吸入性麻醉劑，容易通過血腦屏障產(chǎn)生中樞抑制，絕大部分以原型經(jīng)呼吸道代謝，撤藥后血液中含量很快下降[5]，基本不影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行。這種由氣道給藥、易于代謝、無呼吸抑制等作用特點(diǎn), 減少了麻藥長期作用的不利風(fēng)險(xiǎn)[6]。

對于大鼠連續(xù)采血來說，尾尖采血法易溶血，眼眶后靜脈采血對動(dòng)物傷害比較大，頸靜脈采血風(fēng)險(xiǎn)較大，心臟穿刺采血法動(dòng)物死亡率較高[7]，然而此法卻克服了以上方法的弊端。大鼠連續(xù)尾靜脈采血13 d，比靜脈留置針安全高效同時(shí)在留置時(shí)間上也有優(yōu)勢[8]，同時(shí)也能避免大鼠的啃咬。

另外，靜脈輸液針，原料易取，購買方便。注射器針頭用軟管連接，增加了靈便型，不易跑針，且采血后可較方便地更換補(bǔ)液的注射器，避免再次穿刺，減少創(chuàng)傷。同時(shí)補(bǔ)液保持血容量，也可保證實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。若需藥物干預(yù)，也同樣方便操作。靜脈輸液針為臨床患者使用，現(xiàn)改裝為SD大鼠取血，這是真正意義上的倫理照顧。大鼠尾靜脈采血時(shí)，注意選擇合適型號的針頭，5.5號針頭較粗，在抽吸力度較大時(shí)易出現(xiàn)血管塌陷，導(dǎo)致血管壁貼附針孔，影響采血速度，但較細(xì)針頭也容易因采血過慢而發(fā)生凝血，導(dǎo)致針頭堵塞，故采血時(shí)需適當(dāng)練習(xí)注射器的抽吸力度。

綜上所述，靜脈輸液針尾靜脈采血具有方法簡便、材料廣泛、成本低廉、安全有效等優(yōu)點(diǎn)，適用于連續(xù)時(shí)間點(diǎn)采集大鼠靜脈血的實(shí)驗(yàn)研究。

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(編輯：楊穎)

Research on methods of continuous blood sampling from caudal vein of rat

WANG Yang1,LU Xiao-fan2,LI Hang-jie1,WU Zhao-huan1，LI Ya3,SONG Xiao-lin1(1.Henan University of Traditional Chinese Medicine,Zhengzhou Henan 450008,China;2.Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100000,China;3.Central Laboratory,First Affiliated Hospital of Henan University of Traditional Chinese Medicine,Zhengzhou Henan 450000,China)

Abstract:ObjectiveTo continuously draw blood from caudal vein of SD rats which controlled by the homemade holder with an improved method, and the effects of this method was evaluated according to the relevant indicators. MethodsThe 24 SD rats should be drew the blood from the caudal vein by the improved disposable infusion needle and supplied physiological saline at the condition of ether inhalation anesthesia and once a day until to the thirteenth day,and then the times of draw blood and the number of survival rats only to calculate the success rate and survival rate of rats were record. ResultsIn the 12 days,the tail vein blood of 24 SD rats were successfully collected. But a rat died of excessive ether inhalation anesthesia on the thirteenth day.The success rate was 99.68% and the rat survival rate was 95.83%. ConclusionThe method that applying an improved disposable infusion needle and supplying physiological saline is safe and effective,flexible and convenient,which is suitable for experimental study that needs to draw blood from caudal vein of the SD rat at the continuous time.

Keywords:SD rat;continuous;caudal vein;blood sampling

[收稿日期]2015-06-20[修回日期] 2015-07-15

[通訊作者]李亞，E-mail：yuanfengtcm@126.com

[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金(81302921)

doi:10.11659/jjssx.05E015059

[中圖分類號]Q95-336

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1672-5042(2015)05-0505-03