李華強，郭春芳，謝黎明，潘永霞　(.重慶市巴南區(qū)人民醫(yī)院病理科,重慶 400;.重慶市巴南區(qū)人民醫(yī)院婦產科, 重慶 400;.重慶市巴南區(qū)人民醫(yī)院神經內科，重慶 400)

TLR4、TLR7蛋白在宮頸鱗癌中的表達及其意義

李華強1，郭春芳1，謝黎明2，潘永霞3(1.重慶市巴南區(qū)人民醫(yī)院病理科,重慶 401320;2.重慶市巴南區(qū)人民醫(yī)院婦產科, 重慶 401320;3.重慶市巴南區(qū)人民醫(yī)院神經內科，重慶 401320)

[摘要]目的探討Toll樣受體4、7(TLR4、TLR7)蛋白在宮頸鱗癌(CSCC)組織中的表達變化及與患者的臨床病理特征的關系。方法選取本院67例確診CSCC患者的癌組織標本(CSCC組)、30例宮頸上皮瘤變患者的宮頸組織標本(CIN組)及30例正常宮頸組織標本(正常組)，采用免疫組化染色法檢測3組標本中的TLR4、TLR7蛋白表達水平差異，并分析CSCC組織標本中TLR4、TLR7蛋白表達與患者的臨床病理特征的關系。結果CSCC組的TLR4、TLR7蛋白表達陽性率分別為80.60%、76.12%，均顯著高于CIN組的46.67%、40.00%和正常組的13.33%、10.00%，且差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；CIN組的TLR4、TLR7蛋白陽性表達率顯著高于正常組(P<0.05)。TLR4蛋白陽性表達與CSCC 患者的FIGO分期、病理分級、浸潤深度有顯著的關系(P<0.05)；TLR7蛋白陽性表達與CSCC 患者的病理分級、浸潤深度有顯著的關系(P<0.05)。結論TLR4、TLR7蛋白在CSCC患者宮頸組織中表達陽性率顯著升高，并且與患者的臨床分期、病理分級等因素有一定的關系。

[關鍵詞]Toll樣受體；宮頸鱗癌；宮頸上皮瘤變；病理特征

Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是重要的跨膜蛋白，是人體的天然免疫分子，能夠識別不同病原微生物的相關分子模式，在發(fā)揮機體免疫功能中扮演重要角色[1]。近年研究顯示，在不同類型的惡性腫瘤組織中均可發(fā)現TLRs的表達，表明TLRs參與了惡性腫瘤的發(fā)生及進展，其機制可能與TLRs抑制細胞凋亡、促進免疫逃逸，參與炎癥反應過程有關[2]。但是，對于子宮頸鱗癌(cervical squamous cell carcinoma,CSCC)，TLRs在癌組織中的表達及其影響作用尚不明確。本研究采用免疫組化、熒光定量PCR檢測以及western blot對CSCC組織及癌旁組織中TLR4與TLR7

的表達水平，探討TLR4與TLR7對CSCC發(fā)生、發(fā)展的影響，旨在進一步明確TLRs對CSCC腫瘤生物學行為的意義，現報告如下。

1資料與方法

1.1臨床資料

選取本院67例確診CSCC患者的癌組織標本(CSCC組)、30例宮頸上皮瘤變患者的宮頸組織標本(CIN組)及30例正常宮頸組織標本(正常組)進行分析。CSCC組67例患者，年齡37～64歲，平均(46.52±9.18)歲。根據國際婦產聯盟(FIGO)分級標準：Ⅰa期2例、Ⅰb期7例、Ⅱa期12例、Ⅱb期18例、Ⅲa期20例、Ⅲb期8例。病理檢查分級：G1期15例、G2期28例、G3期24例，淋巴結轉移26例。CIN組30例患者，年齡28～58歲，平均(44.57±10.26)歲，CINⅠ11例 CINⅡ 12例、CINⅢ 7例。正常組30例，年齡30～60歲，平均(45.83±11.27)歲。3組研究對象的年齡構成差異不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。納入標準：CSCC患者的宮頸組織標本來源于本院手術切除后的經病理活檢確診的CSCC患者；宮頸上皮瘤變患者組織標本來源于陰道鏡取活組織病理檢查確診的患者；正常宮頸組織標本來源于本院婦科檢查活組織檢查證實為正常的宮頸組織標本；宮頸癌患者及CIN患者取標本前均未接受放療、化療或者免疫治療。排除標準：未經過病理檢查證實的患者；取標本前接受過相關治療的患者；一般資料不完整的患者。

1.2免疫組化檢測方法

異硫酸氰胍法提取癌組織標本、宮頸上皮瘤變患者及正常組的宮頸組織標本RNA，提取后-80 ℃冰凍保存。用紫外分光光度計測出總 RNA 的含量。取1∶1RNA 樣品稀釋成30∶1。在紫外分光光度儀上分別測出A260和A280處的值。計算出 A260/A280的比值；純度較好的 RNA樣品比值應為1.8～2.0。若OD260/OD280小于1.7，說明提取物中混入蛋白，需要重新提取總 RNA，并將實驗所RNA濃度調整至20 ng/μL。

1.3免疫組化結果判定標準

免疫組織化學法的結果判定標準，免疫組化染色結果為黃色或棕黃色顆粒，隨機選取10個視野在400倍高倍鏡下進行觀察，按照著色強度進行分級：0分為無色；淡黃色為1分；棕黃色為2分，褐色為3分。顯微鏡下染色陽性細胞計數：1%～25%為1分；26%～50%為2分；51%～75%為3分；75%以上為4分。2個得分項目相加為最終評分，(-)為總分低于3分，陰性表達；(+)為3分，弱陽性表達；(++)為4分，中陽性表達；(+++)為5分，強陽性表達。

1.4統(tǒng)計學分析

2結果

2.1TLR4、TLR7蛋白在3種宮頸組織中的表達情況

CSCC組的TLR4、TLR7蛋白表達陽性率分別為80.60%、76.12%，均顯著高于CIN組的46.67%、40.00%和正常組的13.33%、10.00%，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；CIN組的TLR4、TLR7蛋白陽性表達率顯著高于正常組(P<0.05)，見表1。免疫組化見圖1～2，可見CSCC組的棕黃色顆粒較多，著色較深，CIN組呈黃色或淡黃色著色，較正常組深。

表1　TLR4、TLR7蛋白在3種宮頸組織中的表達[例(%)]

*：與CSCC組比較,P<0.05；#：與正常組比較，P<0.05

a:正常組;b:CIN組;c:CSCC組

圖1TLR4蛋白的免疫組化結果(SP,×400)

a:正常組;b:CIN組;c:CSCC組

2.2TLR4、TLR7蛋白的表達與臨床病理特征的關系

TLR4蛋白陽性表達與CSCC患者的FIGO分期、病理分級、浸潤深度有顯著的關系(P<0.05)；TLR7蛋白陽性表達與CSCC患者的病理分級、浸潤深度有顯著的關系(P<0.05),見表2、表3。

3討論

TLRs主要存在于機體免疫細胞中，其主要功能是識別病原體的分子模式，調節(jié)天然免疫反應，介導炎癥反應，發(fā)揮抵御病原微生物侵襲的重要作用[3]。新近研究表明，TLR4、TLR7的表達與原發(fā)性及感染性腎臟疾病的發(fā)病有關[4]。另外，還有研究顯示TLRs不僅存在機體的免疫組織中，還存在于不同類型的腫瘤細胞中，例如黑色素瘤、宮頸癌、前列腺癌、胃癌、喉癌、神經母細胞瘤、肺癌等癌組織細胞中均發(fā)現TLRs的廣泛表達，因此推測TLRs可能影響惡性腫瘤的發(fā)病，而且在其生物免疫治療中發(fā)揮一定作用[5-6]。但是關于CSCC中TLRs的表達尚未明確。本研究探討了CSCC組織中TLR4與TLR7的表達水平，并與正常組織細胞進行比較，分析TLR4、TLR7與CSCC的發(fā)生、發(fā)展的關系。

表2　TLR4蛋白的表達與CSCC患者的臨床病理特征關系

表3　TLR7蛋白的表達與CSCC患者的臨床病理特征關系

腫瘤細胞所處的機體內外環(huán)境，是影響腫瘤發(fā)生與轉移的重要因素。腫瘤組織細胞生存的微環(huán)境是一個復雜的網絡系統(tǒng)，由各種不同類型的細胞及細胞介質組成。當前，已有不少研究關注TLRs信號通路在腫瘤發(fā)病及進展中的影響作用，細胞因子是其中的關鍵一環(huán)，對腫瘤的生長起著復雜的影響作用。感染或機體組織損傷引發(fā)的炎癥反應能夠啟動腫瘤的發(fā)病過程，而腫瘤生長能夠模擬組織損傷的生理機制，誘導TLRs依賴性炎癥，進一步促進腫瘤的生長進程[3]。研究表明，TLRs對NK細胞、巨噬細胞等一類機體固有免疫細胞具有活化作用，同時還能夠激活下游信號分子，例如核轉錄因子NF-κB、以及絲裂原活化蛋白激酶、干擾素調節(jié)因子1、7等，并通過對抗原遞呈細胞的介導作用，參與炎癥反應，增加促炎因子的激活水平[7]。TLRs一旦與機體中存在的相應配體相結合，能夠促進上皮細胞的表型轉變，促進細胞因子的合成，介導腫瘤組織的免疫逃逸，促進腫瘤細胞的生長、轉移[8]。肖晶晶等[9]研究指出，在HPV陽性子宮頸癌患者中，可發(fā)現TLR4通路關鍵基因的高水平表達，推測TLR4通路的激活與HPV感染可能存在相關，兩者共同調節(jié)局部免疫微環(huán)境，造成腫瘤細胞的免疫逃逸，誘導子宮頸腫瘤的形成；Hasimu等[10]以維吾爾族患者為研究對象，探討HPVl6感染與TLR4表達水平的關系，結果表明，子宮頸癌中TLR4水平明顯升高，與HPVl6感染顯著正相關。Bergman等[11]研究表明頭頸部鱗狀細胞癌組織中，TLR4水平與腫瘤分級密切相關，但不存在明顯的突變基因。

本研究結果顯示，CSCC組織TRL4與TRL7的表達陽性率明顯高于癌旁組織；CSCC組織TRL4與TRL7的mRNA水平明顯高于癌旁組織；CSCC組織TRL4與TRL7的蛋白表達明顯高于癌旁組織，提示TLR4、TLR7蛋白與mRNA在CSCC中的表達明顯，與癌旁組織存在明顯差異。因此我們推測，在CSCC患者的子宮頸微環(huán)境中，可能存在TLR4、TLR7蛋白分子的內源性配體，從而誘導TLR4、TLR7信號通路的激活，介導機體局部炎癥反應，通過一系列復雜的信號傳導途徑，TLR4、TLR7能夠激活多個下游分子，例如NF-KB、P38、JNK及IFN等一系列調節(jié)因子，從而促進癌細胞的生長與增殖，抑制癌細胞凋亡，促進癌細胞浸潤及轉移。我們認為，TLR4、TLR7可能成為CSCC發(fā)病的生理機制以及治療靶點的研究提供一個新的方向，具有潛在的應用前景。但是，對于TLR4、TLR7在CSCC微環(huán)境中的具體作用機制，將是我們以后進一步研究的重要課題。

[參考文獻]

[1] 孫午,熊鶯,王敏,等.黃芩苷對人淋巴細胞Toll樣受體的調節(jié)[J].中國免疫學雜志,2012,28(8):706-711.

[2] 張小立,馮修高.TLR4分子相關疾病及其臨床上潛在的應用價值[J].中華臨床醫(yī)師雜志(電子版),2013,7(5):2192-2194.

[3] 馬玉著.子宮頸鱗癌組織中TOLL樣受體4、7和9蛋白的表達及意義[D].安徽醫(yī)科大學,2014.

[4] 張芳敏,韓子明,趙德安.Toll樣受體4和Toll樣受體7在兒童原發(fā)性腎病綜合征患兒腎組織中的表達及意義[J].臨床兒科雜志,2014,32(6):512-516.

[5] 周曉妮,楊歡,溫會燕,等.Toll樣受體在不同轉移能力人乳腺癌細胞株中的差異表達及意義[J].中華實驗外科雜志,2011,28(5):662-664.

[6] Vaisanen MR,Vaisanen T,Jukkola-VuorinenA,et al.Expression of toll-like receptor-9 is increased inpoorly differentiated prostate tumors[J].Prostate,2010,70(8):817-824.

[7] 薛源,韓悅,張欣欣.Toll樣受體在肝衰竭發(fā)病中的作用研究進展[J].實用肝臟病雜志,2014,17(6):665-668.

[8] 張瑞平,買買提艾力·吾馬爾,馬紅,等.新疆哈族和漢族食管癌中Toll樣受體的表達及其與腫瘤細胞浸潤和轉移的關系[J].臨床與實驗病理學雜志,2012,28(4):362-367.

[9] 肖晶晶,郭奇桑,王憲政,等.TLR4/NO通路在高危型HPV陽性的子宮頸癌組織和細胞中的表達及意義[J].中華婦產科雜志,2015,50(1):41-47.

[10] Hasimu A,Ge L,Li QZ,et al.Expressions of Toll-like receptors 3,4,7,and 9 in cervical lesions and their correlation with HPV 16 infection in Uighur women[J].Clin J Cancer,2011,30(5):344-350.

[11] Bergmann C,Bachmann HS,Bankfalvi A,et al.Toll-like receptor 4 single-nucleotide polymorphisms Asp299Gly and Thr399Ile in head and neck squamous cell carcinomas[J].J Transl Med,2011,9(97):6419-6426.

(編輯：楊穎)

Expression of TLR4 and TLR7 protein in cervical squamous cell carcinoma

LI Hua-qiang1,GUO Chun-fang1,XIE Li-ming2,PAN Yong-xia3(1.Department of Pathology,the People’s Hospital of Banan,Chongqing 401320,China;2.Department of Gynaecology and Obstetrics,the People’s Hospital of Banan,Chongqing 401320,China;3.Department of Neurology,the People’s Hospital of Banan,Chongqing 401320,China)

Abstract:ObjectiveTo study the changes of Toll like receptor 4,7 (TLR4,TLR7) protein in cervical squamous cell carcinoma(CSCC) tissues and the relationship between expression and clinical pathological characteristics of the patients. MethodsA total of 67 patients with CSCC carcinoma(CSCC group),30 patients with cervical intraepithelial neoplasia(CIN group) and 30 patients with normal cervical tissues(normal group) were detected by immunohistochemical method.The expression of TLR4,TLR7 protein and its clinical pathological characteristics of patients with CSCC in the samples were analyzed. ResultsTLR4,TLR7 protein positive rate of CSCC group were respectively 80.60% and 76.12%，which were significantly higher than those of CIN group (46.67%,40.00%) and the normal group(13.33%,10.00%),the difference was statistically significant (P<0.05).TLR4,TLR7 protein positive expression rate in CIN group was significantly higher than that in the normal group (P<0.05).The positive expression of TLR4 protein and CSCC in patients with FIGO stage,pathological grade,depth of invasion had a significant relationship(P<0.05),pathological grade,the positive expression of TLR7 protein and CSCC in patients with invasive depth had a significant relationship(P<0.05). ConclusionThere is increased expression of TLR4,TLR7 protein in cervical tissues of CSCC patients,and a certain relationship between the factors and clinical staging,pathological grading.

Keywords:Toll like receptor;cervical carcinoma;cervical intraepithelial neoplasia;pathology

[收稿日期]2015-06-20[修回日期] 2015-07-15

[通訊作者]潘永霞，E-mail:54129839@qq.com

doi:10.11659/jjssx.06E015103

[中圖分類號]R365

[文獻標識碼]A

[文章編號]1672-5042(2015)05-0502-04