姚基偉,李前偉,付衛(wèi)華,鄭　霽,鄢俊安,李為兵　(第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院泌尿外科, 重慶 400038)

URAT1基因在尿酸結(jié)石患者腎臟的表達及其臨床意義

姚基偉,李前偉,付衛(wèi)華,鄭霽,鄢俊安,李為兵(第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院泌尿外科, 重慶 400038)

[摘要]目的探討尿酸結(jié)石患者尿酸代謝特征以及腎臟URAT1表達改變的意義。方法回顧性分析2012年1月至2013年10月我院收治的24例結(jié)石患者的臨床資料，按結(jié)石成分分為尿酸結(jié)石患者9例(A組)、非尿酸性結(jié)石患者15例(B組)，另選取7例因其他疾病操作而取材做mRNA測定的患者為C組，10例健康體檢者為D組(僅用作收集其血尿酸檢驗結(jié)果以及24 h尿液標本)。采集各組參與者一般臨床資料以及血液、24 h尿液的尿酸代謝相關(guān)指標結(jié)果，并應(yīng)用Real-time PCR技術(shù)檢測其腎臟URAT1表達情況，所得數(shù)據(jù)進行組間統(tǒng)計分析比較。結(jié)果A組患者血尿酸水平、體重指數(shù)、年齡顯著高于B組及C組(P<0.05)，而尿PH值顯著降低。24 h尿量及尿酸定量分析各組間無明顯差異(P>0.05)。Real-time PCR實驗結(jié)果提示尿酸結(jié)石患者腎臟URAT1表達較其他組顯著增高(P<0.05)。結(jié)論尿酸結(jié)石患者與高尿酸血癥密切相關(guān)，而腎臟尿酸排泄無明顯改變， URAT1在腎臟高表達可能是這一臨床特征的重要分子機制。

[關(guān)鍵詞]尿酸鹽陰離子交換器; 尿酸; 腎結(jié)石

尿酸結(jié)石發(fā)病率因不同國家而異，在美國占泌尿系結(jié)石的8%～10%[1]。我國尿酸結(jié)石發(fā)病率僅次于草酸鈣結(jié)石，占泌尿系結(jié)石的14%～24%，且隨著人民生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改善, 尿酸結(jié)石的發(fā)病率呈上升趨勢[2]。其發(fā)病機制目前尚不清楚，普遍認為高尿酸血癥與高尿酸尿、尿量不足、持續(xù)性酸性尿是促發(fā)尿酸結(jié)石形成的三大主要因素，其中尿酸代謝異常是尿酸結(jié)石形成的重要病理機制之一[3]。

尿酸是人類嘌呤代謝的終產(chǎn)物。血尿酸水平取決于機體內(nèi)尿酸的產(chǎn)生與排泄之間的平衡。人體內(nèi)尿酸

主要通過腎臟排泄，后者主要依賴于腎近曲小管轉(zhuǎn)運蛋白構(gòu)成的離子通道完成。已知腎小管尿酸轉(zhuǎn)運蛋白中，表達于腎皮質(zhì)近曲小管上皮細胞的人尿酸鹽陰離子交換器(urate transporter 1，URAT1)和葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白9(glucose transporter 9,GLUT9)是介導(dǎo)腎臟尿酸的重吸收，維持血、尿酸穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)運體[4]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)尿酸結(jié)石患者血尿酸水平明顯升高，反之尿液排泄尿酸無明顯變化；腎組織學(xué)實驗證實尿酸結(jié)石患者近曲小管上皮細胞URAT1蛋白表達增加。實驗結(jié)果支持尿酸結(jié)石形成與腎尿酸代謝異常密切相關(guān)，并提示URAT1在腎近曲小管高表達可能是尿酸結(jié)石患者高尿酸血癥形成的重要分子機制，但未探明是否存在腎URAT1基因表達的改變[5]。本研究在前期研究基礎(chǔ)上，探討尿酸結(jié)石患者的尿酸代謝特征及其腎臟URAT1基因表達情況，為進一步研究URAT1在尿酸結(jié)石發(fā)病機制中的作用提供理論基礎(chǔ)及重要線索。

1資料與方法

1.1標本來源

收集本科2012年1月至2013年10月結(jié)石患者術(shù)前24 h尿、經(jīng)皮腎術(shù)中穿刺獲取的腎標本以及手術(shù)取出的部分結(jié)石。經(jīng)結(jié)石成分分析確診尿酸結(jié)石患者9例(A組)，非尿酸性結(jié)石患者15例(B組)。用于檢測URAT1表達的正常對照組(C組)腎臟標本來自7例因急性腎臟外傷接受腎修補或腎切手術(shù)的患者，且術(shù)前檢查均證實無泌尿系結(jié)石、尿酸代謝異常。此外，用于比較尿酸代謝特征的正常對照組(D組)血、尿液標本來自10例健康體檢者。研究方案獲得第三軍醫(yī)大學(xué)倫理委員會同意，所有研究對象在完全自愿情況下簽署樣本獲取知情同意書。

1.2尿酸代謝特征檢測

采集A、B、D組參與者的一般臨床資料，收集結(jié)石患者術(shù)前及正常對照組血、24 h尿液標本，分別進行尿酸定量檢測。

1.3腎臟URAT1基因表達檢測

A、B、C組腎標本留取腎皮質(zhì)部分用做實驗。采用Tripure分離試劑一步法提取標本總RNA。參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將所提取RNA樣本逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。目的基因URAT1引物序列：上游5’-CCCCACACCCGTCCACCTG-3’，下游5’-GGGCTGGGTTTGGGGGTTAAG-3’；內(nèi)參基因GAPDH引物序列：上游 5’-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3’，下游 5’-AGGGGCCATCCAGTCTTC-3’。熒光定量PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s，72 ℃ 10 min，39個循環(huán)，Bio-Rad 熒光定量PCR儀隨機附帶軟件計算CT值與拷貝數(shù)。以內(nèi)參基因作為參照，計算2-ΔΔct值視為目的基因相對表達量。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

2結(jié)果

2.1尿酸結(jié)石患者尿酸代謝特點

A、B、D共收集34例調(diào)查對象的一般資料、血尿酸、24 h尿液中尿酸定量指標。各變量組間統(tǒng)計結(jié)果顯示：尿酸結(jié)石患者血尿酸水平較非尿酸性結(jié)石患者以及正常對照組都顯著升高(P<0.05)，而24 h尿量以及尿酸排泄3組間無明顯差異；此外，尿酸結(jié)石患者發(fā)病年齡、體重指數(shù)明顯高于非尿酸性結(jié)石患者，而其尿液PH值明顯低于其他2組(P<0.05)，見表1。

2.2尿酸結(jié)石患者腎URAT1表達情況

A、B、C組共31例腎臟樣本用于Real-time PCR檢測URAT1表達情況(圖1)，2-ΔΔct值用于統(tǒng)計各組樣本mRNA相對表達量。組間比較結(jié)果顯示尿酸結(jié)石患者腎臟URAT1 mRNA表達水平明顯高于非尿酸結(jié)石組以及正常對照組(P<0.05)，后2組腎臟樣本間URAT1 mRNA表達水平無顯著差異(P>0.05)，見圖2。

表1　各組臨床資料比較分析

*：與A組比較，P<0.05

圖1　Real-time PCR標準曲線

*：與A組比較，P<0.05

3討論

URAT1被Enomoto等[6]和So等[7]在腎臟首次發(fā)現(xiàn)并報道，它由有機陰離子編碼家族SLC22A的SLC22A12基因編碼的一種膜轉(zhuǎn)運蛋白，特異表達在腎臟近曲小管上皮細胞的刷狀緣側(cè)，經(jīng)過十余年的研究，大量證據(jù)表明URAT1作為腎臟尿酸代謝的轉(zhuǎn)運體，是維持人體尿酸代謝生理平衡的關(guān)鍵蛋白，并在尿酸代謝異常的病理機制中發(fā)揮重要作用[7]。在正常生理狀態(tài)下，血液內(nèi)尿酸在腎小球自由濾過進入原尿，后者途徑腎近曲小管時，90%以上的尿酸通過URAT1轉(zhuǎn)運至小管上皮細胞內(nèi)，并由上皮細胞基底側(cè)膜上GLUT9等轉(zhuǎn)運體轉(zhuǎn)運吸收入血[8]。在尿酸代謝異常病理機制研究中發(fā)現(xiàn)，URAT1基因突變及其單核苷酸多態(tài)性是先天性腎性低尿酸血癥、高尿酸血癥以及痛風(fēng)重要的發(fā)病分子機制[9-10]。我們前期研究也顯示腎近曲小管上皮細胞URAT1蛋白高表達與尿酸結(jié)石發(fā)病密切相關(guān)[5]。

尿酸結(jié)石形成的分子機制研究目前尚處于初步階段。流行病學(xué)研究顯示其發(fā)病可能與肥胖、Ⅱ型糖尿病、高尿酸血癥以及痛風(fēng)等代謝性疾病相關(guān)[1]；尿酸結(jié)石患者代謝特征分析發(fā)現(xiàn)，此類患者比較其他類型的泌尿系結(jié)石患者血尿酸水平顯著增高、而尿PH值明顯降低；但24 h尿液分析發(fā)現(xiàn)尿酸、鈣、草酸和檸檬酸鹽的排泄無明顯差異[11-12]。我們的臨床數(shù)據(jù)分析結(jié)果也支持此前研究發(fā)現(xiàn)。值得關(guān)注的是，此前普遍認為尿量減少以及高尿酸尿癥是尿酸結(jié)石形成的重要因素，但鮮有臨床報道支持這一結(jié)論。盡管處于高血尿酸水平的狀態(tài)下，尿酸結(jié)石患者24 h尿量以及尿酸排泄量與其他泌尿系結(jié)石患者及正常對照人群比較并無明顯差異，其分子機制目前尚未見報道。本研究發(fā)現(xiàn)尿酸結(jié)石患者腎近曲小管尿酸重吸收關(guān)鍵轉(zhuǎn)運蛋白URAT1顯著增加，這可能是其尿酸代謝特征的重要機制。

綜上所述，我們通過臨床數(shù)據(jù)分析及組織學(xué)實驗發(fā)現(xiàn)尿酸結(jié)石患者與高尿酸血癥密切相關(guān)，而腎臟尿酸排泄無明顯改變， URAT1在腎臟高表達可能是這一臨床特征的重要分子機制。本研究為進一步研究尿酸結(jié)石形成機制提供了重要的線索及理論基礎(chǔ)。

[參考文獻]

[1] Sakhaee K.Epidemiology and clinical pathophysiology of uric acid kidney stones [J].J Nephrol，2014,27(3):241-245.

[2] 葉章群,鄧耀良,董誠.泌尿系結(jié)石 [M].北京:北京人民衛(wèi)生出版社, 2003:268.

[3] 樊玲靜.紅外光譜自動分析儀對尿路結(jié)石成分的分析與預(yù)防對策的探討[J].局解手術(shù)學(xué)雜志,2012,21(4):434.

[4] Anzai N,Endou H.Urate transporters:an evolving field [J].Semin Nephrol,2011,31(5):400-409.

[5] Fu W,Li Q,Yao J,et al.Protein expression of urate transporters in renal tissue of patients with uric acid nephrolithiasis[J].Cell Biochem Biophys，2014,70(1):449-454.

[6] Enomoto A,Kimura H,Chairoungdua A,et al.Molecular identification of a renal urate anion exchanger that regulates blood urate levels [J].Nature，2002,417(6887):447-452.

[7] So A,Thorens B.Uric acid transport and disease [J].J Clin Invest,2010,120(6):1791-1799.

[8] Lipkowitz MS.Regulation of uric acid excretion by the kidney [J].Curr Rheumatol Rep,2012,14(2):179-188.

[9] Wakida N,Tuyen DG,Adachi M,et al.Mutations in human urate transporter 1 gene in presecretory reabsorption defect type of familial renal hypouricemia [J].J Clin Endocrinol Metab,2005,90(4):2169-2174.

[10] Tin A,Woodward OM,Kao WH,et al.Genome-wide association study for serum urate concentrations and gout among African Americans identifies genomic risk loci and a novel URAT1 loss-of-function allele[J].Hum Mol Genet,2011,20(20):4056-4068.

[11] Friedlander JI,Moreira DM,Hartman C,et al.Comparison of the metabolic profile of mixed calcium oxalate/uric acid stone formers to that of pure calcium oxalate and pure uric acid stone formers[J].Urology，2014,84(2):289-294.

[12] Moreira DM,Friedlander JI,Hartman C,et al.Using 24-hour urinalysis to predict stone type[J].J Urol,2013,190(6):2106-2111.

(編輯：楊穎)

Expression and clinical significance of URAT1 in renal tissue of patients with uric acid nephrolithiasis

YAO Ji-wei,LI Qian-wei,FU Wei-hua,ZHEN Ji,YAN Jun-an,LI Wei-bing(Center of Urology,Southwest Hospital,Third Military Medical University,Chongqing 400038,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the metabolic profile of uric acid and the significance of the altered renal expression of urate transporter 1(URAT1) in patients with uric acid nephrolithiasis. MethodsThe data of 24 patients in our hospital from January 2012 to October 2013 were analyzed retrospectively.Participants in the research were divided into three groups:patients with uric acid nephrolithiasis,other patients with nephrolithiasis and normal participants.The basic clinical data and the related data of uric acid metabolition of participants were collected,URAT1 gene expression in renal tissures of three groups was detected by Real-time PCR technique.All data were statistically analyzed and compared between these groups. ResultsUric acid levels in plasma,body mass index and age were significantly higher in patients with uric acid nephrolithiasis than other two groups (P<0.05),but urine PH value was significantly reduced in patients with uric acid nephrolithiasis.Urine and uric acid output of 24 hours urine were no significant difference among the three groups (P>0.05).The result of Real-time PCR suggested that the URAT1 renal expression was significantly higher in patients with uric acid nephrolithiasis than other two groups (P<0.05). ConculusionPatients with uric acid nephrolithiasis are closely related with hyperuricemia,but unrelated with renal over-excretion of uric acid.The upregulated URAT1 expression in the kidney may be an important molecular mechanism of the clinical features.

Keywords:URAT1;uric acid;nephrolithiasis

[收稿日期]2015-02-11[修回日期] 2015-02-27

[通訊作者]李為兵,E-mail：liweibing63@yahoo.com.cn

[基金項目]重慶市自然科學(xué)基金(2011BA5011)

doi:10.11659/jjssx.08E014051

[中圖分類號]R692.4

[文獻標識碼]A

[文章編號]1672-5042(2015)05-0484-03