王衛(wèi)軍 楊建敏① 董迎輝 臧恒昌 王中平 孫國華

(1. 山東省海洋資源與環(huán)境研究院 山東省海洋生態(tài)修復(fù)重點實驗室 煙臺 264006; 2. 浙江萬里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院 寧波315100; 3. 山東大學(xué)藥學(xué)院 國家糖工程技術(shù)研究中心 濟(jì)南 250012; 4. 崆峒島實業(yè)有限公司 煙臺 264000)

近紅外(Near Infrared,NIR)技術(shù)是一種對有機物成分含量快速分析的新型分析技術(shù),它可以同時檢測出樣品中的多種成分參數(shù)。與傳統(tǒng)的化學(xué)檢測方法相比,NIR技術(shù)具有高通量、省時、省力、低成本以及環(huán)保無污染的特點(Osborneet al,1993)。NIR技術(shù)是研究動物肉質(zhì)性狀成分指標(biāo)的高效方法,在選擇育種和成分含量快速檢測方面應(yīng)用廣泛。Zamora-Rojas等(2011)將 NIR技術(shù)應(yīng)用于西班牙伊比利亞豬肉質(zhì)性狀的選育(Iberian Pig Breeding,IPB),由于每年需要對大量候選個體的多項指標(biāo)進(jìn)行分析檢測,NIR技術(shù)的使用使得檢測時間和成本大大降低。Zome?o等(2012)通過建立 NIR模型,快速分析了選育系143個家兔的肌間脂肪酸的變化,大大提高了實驗效率。Folkestad等(2008)建立了大西洋鮭肉質(zhì)中脂肪和色素含量的分析模型,解決了鮭魚肉質(zhì)分析過程中兩個指標(biāo)的同時、快速和無損傷檢測的難題。Fluckiger等(2011)建立了鮑活體、新鮮樣組織和冷凍干燥腹足肌樣品的糖原含量快速檢測模型,并成功進(jìn)行了預(yù)測分析。Wu等(2013)運用NIR技術(shù)檢測鮭魚肉質(zhì)的保水能力,化學(xué)真實值與光譜預(yù)測值的相關(guān)系數(shù)到達(dá)0.941,準(zhǔn)確度非常高。NIR技術(shù)的應(yīng)用,大大提高了肉質(zhì)性狀成分的分析效率,并顯著的降低了檢測成本。

長牡蠣(Crassostrea gigas)又稱太平洋牡蠣,具有環(huán)境適應(yīng)性強、生長迅速、營養(yǎng)豐富等優(yōu)點,是產(chǎn)量最高的世界廣布性大宗經(jīng)濟(jì)貝類。2013年我國牡蠣總產(chǎn)量達(dá) 421.9萬 t (農(nóng)業(yè)部漁業(yè)漁政管理局,2014),為人們提供了豐富的蛋白源。牡蠣不同的風(fēng)味和營養(yǎng)品質(zhì)影響著消費者的消費傾向,進(jìn)而決定著其商品價值。隨著生活水平的不斷提高,人們對于牡蠣的消費,更加注重肉質(zhì)的風(fēng)味和營養(yǎng),而牡蠣的肉質(zhì)性狀是決定其口感和營養(yǎng)品質(zhì)的重要經(jīng)濟(jì)性狀,選育口感佳、營養(yǎng)好的新品種是牡蠣高端市場的迫切需求。目前,對于長牡蠣育種方面的研究主要集中在利用雜種優(yōu)勢進(jìn)行種間雜交(張躍環(huán)等,2014),殼色新品系的選育(叢日浩等,2014)和群體選育快速生長新品系(王慶志等,2013)方面,有關(guān)牡蠣肉質(zhì)性狀新品系選育的工作在國內(nèi)外均未見報道。究其原因,是因為對肉質(zhì)性狀進(jìn)行新品種選育時需要對大量候選個體進(jìn)行多個營養(yǎng)指標(biāo)的分析,傳統(tǒng)的化學(xué)檢測方法具有耗時長、效率低、檢測成本高的缺點。因而,建立快速高效的肉質(zhì)性狀分析模型是開展牡蠣肉質(zhì)性狀新品系選育的基礎(chǔ)。本研究測定了長牡蠣8種成分含量,并運用NIR技術(shù)建立了分析預(yù)測模型; 研究結(jié)果對開展大規(guī)模長牡蠣多種成分含量,選育肉質(zhì)性狀長牡蠣新品系具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設(shè)備

傅里葉變換 NIR光譜儀(Antaris MX,USA),配備 RESULTTM樣本光譜采集的集成軟件以及數(shù)據(jù)處理軟件 TQ analyst (Thermo Fisher,USA),酶標(biāo)儀(BIO-RAD,USA)、原子熒光光譜儀(PA-10)和微波消解系統(tǒng)(Mars Xpress,USA)、高效液相色譜儀(Waters Inc.,USA)、火焰原子吸收分光光度計(AA-800,USA)、自動凱氏定氮儀(FOSS kjeltecTM2300,Sweden)、索氏提取器、馬福爐和大型真空冷凍干燥機(ZDGX5),勻漿機(IKA?T18 basic ULTRA-TURRAX?,Germany)。

1.2 樣本采集

本實驗在2012年11月—2013年8月期間,分別從山東乳山、芝罘島、崆峒島和劉公島,遼寧東港和小山島,江蘇贛榆等長牡蠣主產(chǎn)區(qū)的7個地點,采集了54批野生和養(yǎng)殖的長牡蠣樣品共計94份,樣品鮮軟體部肉重(不包含閉殼肌)為 0.51—44.69g,樣品包含了0.5齡貝、1.5齡貝和2.5齡貝。在不能辨別雌雄的季節(jié),將同批樣品依據(jù)大個體和小個體分為兩組,作為極大值樣本組和極小值樣本組; 在2013年 5—7月,根據(jù)雌雄不同,將同批樣品分為雌雄樣本組。

1.3 樣品前處理

將長牡蠣進(jìn)行解剖,取軟體組織,每份樣本20—60g,放置在50mL的冷凍離心管中。首先用剪刀將軟組織剪碎,再用勻漿機在最大轉(zhuǎn)速勻漿30—50s,勻漿過程中,將離心管置于冰盒中。將勻漿好的樣本分為兩部分: 一部分用于NIR光譜采集,另一部分用于8種成分含量的化學(xué)測定分析。

1.4 近紅外光譜采集

光譜掃描前,應(yīng)用RESULT集成軟件編定樣品光譜采集的工作流程,并使光譜儀開機預(yù)熱至少0.5 h。在直徑 1cm的石英杯中加入高度為 1.5cm勻漿好的樣本。采用漫反射光譜,光譜掃描波數(shù)范圍 10000—4000 cm–1,掃描次數(shù)為 32次,分辨率為 8 cm–1,用log(1/R)漫反射方法表示吸收光譜。測量時環(huán)境溫度為20 °C,相對濕度為10 %。每次采集樣品前采集背景光譜來消除背景的影響,測量時間小于1 min。

1.5 化學(xué)真實值測定

在山東省海洋資源與環(huán)境研究院中心實驗室對94份樣本的 8種成分含量的化學(xué)真實值的進(jìn)行了測定?？偟鞍踪|(zhì)、總脂肪、鋅和硒和灰分含量的測定,依據(jù)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行(中華人民共和國衛(wèi)生部,2010a,b;中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫局等,2008a,b,c); ?；撬岷康臏y定參考陳申如等(2013); 糖原含量測定使用 EnzyChromTM糖原試劑盒(BioAssay Systems,USA)。

1.6 模型建立和驗證

利用TQ Analyst (version 9.1.17,USA)軟件處理采集的光譜數(shù)據(jù),選用偏最小二乘法(Partial Least Squares,PLC)作為建立定標(biāo)模型的化學(xué)計量方法,選擇軟件自動推薦的光譜范圍,并對模型進(jìn)行優(yōu)化和檢驗,篩選最佳的光譜預(yù)處理方法,以確保獲得數(shù)理指標(biāo)最理想的數(shù)學(xué)模型。

通過交叉驗證的方法來對模型進(jìn)行內(nèi)部驗證,即: 每次從校正樣品集中取出1個樣品作為臨時驗證樣品,以其余的樣品進(jìn)行建模,然后對這1個樣品進(jìn)行預(yù)測,如此循壞,則會分別得到所有樣品的交叉預(yù)測值。而外部驗證則是重新收集一批標(biāo)準(zhǔn)樣品用作驗證樣品。內(nèi)部驗證和外部驗證的預(yù)測值對比分析從而得到模型的參考值。主要通過比較預(yù)測值與化學(xué)分析值的相關(guān)系數(shù)(R)、交互驗證殘差均方根(Root mean square error of cross-validation,RMSECV)、預(yù)測殘差均方根(Root mean square error of external prediction,RMSEP)和 RPD(驗證用樣本真實值的標(biāo)準(zhǔn)差(SD)與RMSECV或者 RMSEP的比值,即 RPDCV=SD/RMSECV 或者 RPDEV=SD/RMSEP)等指標(biāo)來衡量定標(biāo)模型的準(zhǔn)確性。由于光譜儀的系統(tǒng)誤差、光譜信號的漂移等原因,所測得樣品的NIR可能出現(xiàn)異常,使得模型預(yù)測精度下降(陳雪英等,2009),本實驗采用TQTMAnalyst軟件中馬氏距離來判別異常點,進(jìn)行樣本異常值的剔除。本實驗中94份樣品的建模集和驗證集的樣本數(shù)見表1。

表1 長牡蠣鮮樣組織建模集和驗證集樣本8種成分含量Tab.1 Composition of the calibration and validation set of flesh tissue samples as determined by chemical reference methods

2 結(jié)果

2.1 長牡蠣鮮樣組織8種成分含量指標(biāo)描述性統(tǒng)計

本實驗在我國多個長牡蠣產(chǎn)地選取不同發(fā)育階段、不同養(yǎng)殖方式和不同年齡的 94份樣品,超過Windham等(1989)所提出的最低樣本數(shù)為 50份的要求。表1為8種不同成分建模集和驗證集樣本的數(shù)目和化學(xué)真實值的分析結(jié)果。實驗中分析的各種成分含量范圍較大,含量最大值與最小值的比值分別為: 水分(1.23),糖原(80.63),總蛋白質(zhì)(3.20),總脂肪(33.74),?；撬?3.28),鋅(5.55),硒(4.97)和灰分(2.51),符合近紅外分析模型建立過程中對樣品含量分布范圍廣的要求。

2.2 光譜數(shù)據(jù)預(yù)處理

長牡蠣鮮樣組織樣本的 NIR漫反射原始光譜如圖1所示。建模過程中對不同成分的光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行不同的平滑處理,最終選擇適合各自成分模型的最佳參數(shù)組合(圖 2)。根據(jù)篩選出的最佳參數(shù)組合,確定長牡蠣鮮樣組織水分、糖原、總蛋白質(zhì)、總脂肪、?；撬帷\、硒、灰分的預(yù)測模型。各成分含量模型所用的光譜范圍、光譜處理方法以及建模用的主因子數(shù)等主要參數(shù)見表2。

2.3 模型建立及優(yōu)化

圖1 長牡蠣鮮樣組織所有樣本的NIR漫反射原始光譜Fig.1 Original NIR spectra of all flesh samples of Pacific oyster C. gigas

根據(jù) TQ Analyst軟件的異常值推薦,不同成分含量樣本異常值的剔除數(shù)見表3。樣本各成分含量建模的結(jié)果中,水分、糖原和總蛋白質(zhì)含量的相關(guān)系數(shù)(RC)較高,均大于0.96,其RMSEC值均較小(圖3a,b,c); 交叉驗證相關(guān)系數(shù)(RCV)和外部驗證的相關(guān)系數(shù)(REV)較高,均大于0.93,其RMSECV值和RMSEP值也較小; 模型驗證的重要參數(shù) RPD值變化范圍為2.80—7.04 (表3),說明水分、糖原和總蛋白質(zhì)含量的模型精確度高,可用于長牡蠣鮮樣組織的成分預(yù)測。另一方面,總脂肪、?；撬?、鋅、硒、灰分含量5個成分,建模過程中的RC值和RMSEC值等參數(shù)均不理想(圖 3d); 交叉驗證和外部驗證的相關(guān)系數(shù)(RCV和REV)均低于0.85,RPD值除Zn含量以外都低于2.5(表3)。綜合考慮多個衡量指標(biāo),總脂肪、牛磺酸、鋅、硒、灰分5個成分含量的NIR模型不適合于長牡蠣鮮肉組織的精確定量分析。

圖2 長牡蠣鮮樣組織糖原含量樣本NIR光譜一階求導(dǎo)處理Fig.2 Glycogen content of NIR treatment with first derivative of flesh tissue samples of Pacific oyster C. gigas

表2 長牡蠣成分含量建模集和驗證集光譜數(shù)據(jù)處理參數(shù)Tab.2 Parameters of the calibration and validation sets for chemical composition in Pacific oyster C. gigas

3 討論

3.1 鮮樣本模型與干樣本模型的比較

本實驗在建立長牡蠣鮮樣組織NIR模型的同時,建立了長牡蠣冷凍干燥樣本的 NIR模型,鮮樣組織(漿狀)和干樣(粉末)樣品兩種不同處理形態(tài)的建模效果存在差異。其中,粉末樣品模型結(jié)果顯示,糖原和總蛋白質(zhì)含量模型可以精確的預(yù)測未知樣本的含量,總脂肪、鋅、硒、灰分含量可準(zhǔn)確的預(yù)測未知樣本的含量,只有?；撬岷磕Ｐ偷念A(yù)測效果不好(未發(fā)表數(shù)據(jù))。長牡蠣鮮樣組織和干樣樣品兩個實驗結(jié)果中,糖原和總蛋白質(zhì)含量建模效果一致,均可以精確的預(yù)測未知樣品; ?；撬岷磕Ｐ驮趦蓚€實驗中均不能準(zhǔn)確的預(yù)測未知樣品; 而鮮樣組織的脂肪、鋅、硒和灰分含量的模型卻不能準(zhǔn)確預(yù)測。Viljoen等(2005,2007)在對鴕鳥肉和羊肉鮮樣組織和冷凍干燥樣品研究過程中發(fā)現(xiàn),冷凍干燥樣品模型的預(yù)測效果更好。對冷凍干燥樣品進(jìn)行光譜分析時,樣品溫度變化不明顯; 而且冷凍干燥樣品可以避免在紅外光譜區(qū)域的非常高的吸收峰(Murrayet al,1987),這些噪音可能降低模型預(yù)測的準(zhǔn)確性(Pedersenet al,2003)。由于長牡蠣鮮樣組織中水分含量高(約 80%),導(dǎo)致光譜采集過程中溫度變化的不確定性,這可能是導(dǎo)致建模不成功的主要原因。

圖3 建模過程中水分、糖原、總蛋白質(zhì)和牛磺酸含量NIR主要參數(shù)Fig.3 NIR parameters of moisture,glycogen,protein and taurine content in the process of modelinga、b、c為精確度高的長牡蠣水分、糖原和總蛋白質(zhì)含量NIR模型的參數(shù)指標(biāo); d為精確度低的NIR模型的參數(shù)指標(biāo)(以?；撬岷繛槔?

3.2 模型建立過程中的主要參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)

在構(gòu)建的模型中,建模相關(guān)系數(shù)(RC)、交互驗證相關(guān)系數(shù)(RCV)和外部驗證相關(guān)系數(shù)(REV)值越接近 1模型的預(yù)測效果越好,在本實驗中,各個相關(guān)系數(shù)都在0.93以上,最高值是0.99,說明模型的精確度非常高。同時模型的 RPD值是衡量模型是否準(zhǔn)確的另一個重要指標(biāo),好的模型具有高的RPD值。當(dāng)RPD值大于 2.5時模型可以進(jìn)行準(zhǔn)確預(yù)測(Guyet al,2011;Zhouet al,2012)。在本實驗中雖然鋅含量預(yù)測模型的RPD值超過 10,但不論是其RC值、RCV值還是REV值均小于0.52,綜合考慮各個指標(biāo),鋅含量的NIR模型不具備準(zhǔn)確預(yù)測的能力。

?；撬崾且环N游離氨基酸,屬于有機物,理論上通過建立 NIR模型,可以準(zhǔn)確的預(yù)測未知樣本的含量。但是本實驗中?；撬岷磕Ｐ皖A(yù)測效果差,分析原因可能是?；撬峄瘜W(xué)真實值的SD值小(Zhouet al,2012),變動范圍窄(Prietoet al,2009)所致。

3.3 模型建立對肉質(zhì)性狀選育的意義

本實驗結(jié)果將用于長牡蠣肉質(zhì)性狀選育、育種世代的鑒定及種質(zhì)資源評價等研究。以上這些方面的研究需要對成千上萬個個體、多個指標(biāo)進(jìn)行成分含量的分析,因此常規(guī)的化學(xué)分析方法難以快捷、高效批量的完成這些分析工作。課題組將運用本實驗結(jié)果對構(gòu)建的長牡蠣家系進(jìn)行成分含量分析,進(jìn)行遺傳參數(shù)估計和育種值估計,將為開展肉質(zhì)性狀選育奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

NIR技術(shù)可以快速精確地測定長牡蠣鮮肉組織(漿狀)中的水分、糖原和總蛋白質(zhì) 3種成分含量,但是對總脂肪、鋅、硒、牛磺酸和灰分含量不能準(zhǔn)確測量。本研究中建立的以上3種成分含量NIR模型,可快速、準(zhǔn)確、無環(huán)境污染地對長牡蠣肉質(zhì)進(jìn)行分析,并對肉質(zhì)性狀選育及育種世代的鑒定和種質(zhì)資源評價都有非常重要的意義。

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