郭 斌，謝 寧，白珊珊，李君安，唐 中

（川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川南充637000）

當(dāng)前侵襲性真菌感染的患病率和病死率均呈逐年上升趨勢(shì)[1-2]，尋找一種適合臨床預(yù)防性治療的藥物已成為防治該病的重要手段。研究發(fā)現(xiàn)，存在于人體唾液中的粘蛋白7（MUC7）是多種微生物黏合劑，特別是其N末端20-mer和12-mer，表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抗多種真菌作用[3-4]，能否尋求一種安全有效的給藥方式成為其臨床應(yīng)用的關(guān)鍵[5-7]。雙歧桿菌是人體腸道內(nèi)的一種益生菌，它能有效抑制有害細(xì)菌及真菌的生長，由于該菌表達(dá)的外源蛋白無需純化可以直接連同菌體一起服用，因此是聯(lián)合抗菌肽開發(fā)微生態(tài)制劑的熱門菌之一。本研究探討了雙歧桿菌單獨(dú)及聯(lián)合MUC7使用體外對(duì)抗各種臨床常見真菌的作用，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株 兩歧雙歧桿菌86321，由重慶醫(yī)科大學(xué)惠贈(zèng)；白色假絲酵母菌ATCC 90028、熱帶假絲酵母菌ATCC 750、克柔假絲酵母菌ATCC 6258、近平滑假絲酵母菌ATCC22019由邁克公司提供。

1.1.2 儀器設(shè)備與試劑 CO2孵箱，生物安全柜，壓力蒸汽滅菌器，厭氧袋，牛津小杯（外徑8mm），沙保培養(yǎng)基，MRS培養(yǎng)基，血平板，氟康唑 NaCl注射液（濃度：2g／L，批號(hào)：A120211），MUC7蛋白1mg，購于北京樂博生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 雙歧桿菌與真菌菌懸液制備 接種兩歧雙歧桿菌于液體MRS培養(yǎng)基中，37℃于孵箱內(nèi)搖瓶厭氧培養(yǎng)48h，調(diào)整菌懸液濃度為2×108CFU／mL；將4種真菌接種于沙保培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)48h，用無菌生理鹽水調(diào)整菌懸液備用，同時(shí)用無菌生理鹽水調(diào)整氟康唑濃度為0.02g／L，調(diào)整MUC7濃度為25 μmol／L。

1.2.2 活菌計(jì)數(shù)法檢測(cè)雙歧桿菌／MUC7組對(duì)真菌的抑制性4種真菌調(diào)菌懸液濃度分別為白色假絲酵母菌2×105CFU／mL，熱帶假絲酵母菌1×104CFU／mL，克柔假絲酵母菌1×104CFU／mL，近平滑假絲酵母菌1×102CFU／mL，再將每1種實(shí)驗(yàn)真菌分為5組：生理鹽水組（NS組）、雙歧桿菌組（BLTA組）、氟康唑組（F組）、MUC7組和雙歧桿菌／MUC7組（BLTA＋ MUC7組），其處理分別為：取等體積50μL生理鹽水、雙歧桿菌菌懸液、氟康唑、MUC7蛋白液與真菌菌懸液50μL混合，雙歧桿菌／MUC7各50μL的混合液與真菌菌懸液100μL混合，分別取等量涂布于血平板，每組平行試驗(yàn)6次；實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組均置37℃孵箱厭氧培養(yǎng)48h后計(jì)數(shù)平板上真菌的菌落數(shù)。

1.2.3 牛津杯法檢測(cè)雙歧桿菌／MUC7組對(duì)真菌的抑制性取濃度為1×107CFU／mL的4種真菌菌懸液70μL作為指示菌，涂布于凝固的血平板，平衡30min。無菌操作將5只無菌的牛津杯放在平板上，杯內(nèi)分別加入生理鹽水100μL、雙歧桿菌100μL、氟康唑100μL、MUC7 100μL、雙歧桿菌＋MUC7 100μL混合液于杯中。平放37℃孵箱厭氧培養(yǎng)48h，測(cè)定它們對(duì)4種真菌形成的抑菌圈大小，并取杯底部、杯外邊緣菌落進(jìn)行革蘭染色觀察對(duì)比，重復(fù)試驗(yàn)6次。

2 結(jié) 果

2.1 活菌計(jì)數(shù)法各處理組真菌生長菌落數(shù)比較 氟康唑組均無真菌生長；4種真菌的BLTA＋MUC7組真菌菌落數(shù)與NS組和BLTA組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；MUC7組與NS組和BLTA組比較差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 活菌計(jì)數(shù)法各處理組真菌生長菌落數(shù)（±s）

表1 活菌計(jì)數(shù)法各處理組真菌生長菌落數(shù)（±s）

a：P＜0.01，與 NS組、BLTA組、MUC7組和BLTA＋MUC7組比較；b：P＜0.05，與 NS組和 BLTA 組比較；c：P＜0.01，與 NS組和BLTA組比較。

菌落數(shù)（n）組別近平滑假絲酵母菌NS組 15.00±2.13 11.00±1.96 29.00±3.56 11.00±1.8白色假絲酵母菌熱帶假絲酵母菌克柔假絲酵母菌9 BLTA 組 10.00±2.25 7.00±1.32 25.00±2.67 7.00±2.14 F組 0a 0a 0a 0a MUC7組 5.00±1.54b 4.00±1.48b 7.00±2.31b 5.00±1.79b BLTA＋MUC7組 2.00±1.13c 2.00±1.42c 5.00±2.03c 2.00±1.39c

2.2 牛津小杯法各處理組抑菌圈大小比較 氟康唑組抑菌圈大小與其他組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；4種真菌的BLTA＋MUC7組抑菌圈大小與NS組和BLTA組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；且 MUC7組與NS組和BLTA組比較差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 牛津杯法各處理組抑菌圈大?。ā纒）

表2 牛津杯法各處理組抑菌圈大?。ā纒）

a：P＜0.01，與 NS組、BLTA組、MUC7組和BLTA＋MUC7組比較；b：P＜0.05，與 NS組和 BLTA 組比較；c：P＜0.01，與 NS組和BLTA組比較。

抑菌圈（mm）組別近平滑假絲8.00±2.63 8.00±1.95 8.00±2.03 8.00±1.67 BLTA 組 9.00±1.56 12.00±2.67 10.00±1.83 12.00±3.73 F組 44.00±2.36a42.00±2.13a40.00±3.01a43.00±4.12a MUC7組 25.00±2.12b 28.00±2.67b 28.00±3.13b 25.00±3.78b BLTA＋MUC7組 29.00±2.17c 31.00±3.25c 29.00±2.89c 30.00±3.36酵母菌NS組白色假絲酵母菌熱帶假絲酵母菌克柔假絲酵母菌c

2.3 各實(shí)驗(yàn)組菌落革蘭染色 牛津杯外邊緣革蘭染色結(jié)果為每個(gè)血平板上NS組均大量真菌生長；BLTA組則為中等量真菌和雙歧桿菌混合生長；F組為極少量真菌生長甚至無菌生長；MUC7組為少量真菌生長；而MUC7＋BLTA組則為極少量真菌和雙歧桿菌混合生長，見圖1。

取牛津杯底部革蘭染色結(jié)果為每個(gè)血平板上NS組仍是大量真菌生長；BLTA組為少量真菌和大量雙歧桿菌混合生長；F組均無菌生長；MUC7組為少量真菌生長；而MUC7＋BLTA組幾乎只有雙歧桿菌生長。此外，BLTA組杯底部革蘭染色發(fā)現(xiàn)對(duì)于熱帶假絲酵母菌，雙歧桿菌大多包裹其混合生長，見圖2。

圖1 牛津杯外邊緣革蘭染色結(jié)果（×1000）

圖2 牛津杯底部革蘭染色結(jié)果（×1000）

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，存在于人體唾液中的MUC7是多種微生物的黏合劑，因此被認(rèn)為是機(jī)體非免疫宿主防御系統(tǒng)的重要組成部分，其主要作用包括調(diào)節(jié)菌群比例和殺滅致病菌。MUC7對(duì)正常菌群可發(fā)揮選擇性黏附并促進(jìn)繁殖，同時(shí)通過掩蔽細(xì)胞表面的致病菌結(jié)合配體，并以自身多肽鏈N末端的微生物結(jié)合區(qū)黏合并殺滅致病菌，從而阻止致病菌定植于細(xì)胞表面[8-10]。Bobek等[3]研究發(fā)現(xiàn) MUC7 20-mer（N-LAHQKPFIR KSYKCLHKRCR-C；residues 32to 51of MUC7）具有高效的抗白色假絲酵母菌、新型隱球菌、光滑假絲酵母菌、克柔假絲酵母菌的作用，且對(duì)部分吡咯耐藥的白色假絲酵母菌、氟康唑耐藥的光滑假絲酵母菌和兩性霉素B耐藥的新型隱球菌也有良好作用；Situ等[11]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在 MUC7 20-mer中的 MUC7 12-mer同樣具有高效的抗真菌活性，且具有分子量更小及ED50藥物用量僅在微摩爾濃度等優(yōu)點(diǎn)；而且MUC7與人體基因同源，因此與其他抗菌肽相比，對(duì)人體正常細(xì)胞沒有毒性作用，具有明顯臨床應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。

但是，抗菌肽的使用須要有效的載體，存在于人體腸道內(nèi)的益生菌雙歧桿菌是有效的腸道保護(hù)性菌種，具有維持和調(diào)整腸道菌群平衡、抑制腸道侵襲性真菌感染、增強(qiáng)免疫功能等諸多生理作用，已作為載體廣泛應(yīng)用于臨床疫苗開發(fā)[12-14]。本研究對(duì)抗菌肽MUC7及其聯(lián)合雙歧桿菌在體外的抑菌效果進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，用以評(píng)價(jià)其殺滅條件致病性真菌的活性。

活菌計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示藥物的抑菌效果仍然是最好的，接種平板幾乎無真菌菌落生長；MUC7組對(duì)臨床常見的真菌均有較好的抑制生長作用，與NS組和BLTA組相比，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。雖然單一的雙歧桿菌對(duì)真菌的抑制作用有限，但與MUC7合用同樣可以達(dá)到好的抑制真菌生長效果，證明兩者合用的可行性。牛津杯法檢測(cè)抑菌作用的結(jié)果顯示MUC7組及MUC7＋BLTA組均有較好的抑菌效果，作用僅次于藥物組，從杯底和外緣的涂片來看，真菌的數(shù)量也較少，且有出現(xiàn)雙歧桿菌包裹真菌生長的現(xiàn)象，同樣證明MUC7與雙歧桿菌聯(lián)合使用的可行性。雖然這樣的作用還不及藥物顯著，但抗真菌藥物存在耐藥性或不良反應(yīng)大，有引起心臟、神經(jīng)系統(tǒng)不良反應(yīng)的可能，特別對(duì)肝臟、腎臟有造成較大損傷可能，必須在用藥期間嚴(yán)密監(jiān)測(cè)，從這個(gè)角度分析，MUC7與人體基因同源，因此對(duì)人體正常細(xì)胞沒有毒性作用，聯(lián)合的雙歧桿菌又是人體正常的益生菌，因此其預(yù)防和治療真菌具有優(yōu)勢(shì)。

綜上所述，本研究的結(jié)果為進(jìn)一步研究口服攜MUC7基因的雙歧桿菌制劑在預(yù)防和治療腸道真菌感染中的臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為臨床抗真菌治療和新型抗真菌藥物的開發(fā)提供了新思路，有望在臨床中發(fā)揮重要作用。

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