張 健，鄭 琪，魏思佳，唐 星，王艷嬌

（沈陽藥科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016）

抗腫瘤藥LS-177的藥物動力學(xué)研究

張 健，鄭 琪，魏思佳，唐 星，王艷嬌*

（沈陽藥科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016）

目的建立一種超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS），測定新藥LS-177比格犬血漿質(zhì)量濃度，并將此方法用于測定LS-177的口服生物利用度，為LS-177口服制劑的研究提供科學(xué)數(shù)據(jù)。方法利用雙周期交叉實(shí)驗(yàn)方案，以比格犬為試驗(yàn)對象，選用液-液萃取的血漿處理方法，利用UPLC-MS/MS法對比格犬血樣進(jìn)行測定。結(jié)果LS-177的血漿質(zhì)量濃度分別在0.1～400和2～2 000 μg·L-1內(nèi)呈線性，方法精密度(RSD)和準(zhǔn)確度(RE)分別小于10.38%和14.71%，LS-177的口服生物利用度為10.05%。結(jié)論建立的UPLC-MS/MS法可用于LS-177的藥物動力學(xué)研究，LS-177口服生物利用度低。

藥劑學(xué)； 藥物動力學(xué)； 超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜；LS-177

研究發(fā)現(xiàn)HGF/c-Met信號通路在很多腫瘤組織包括肺癌組織中會出現(xiàn)異常的活化。而c-Met的過度擴(kuò)增、表達(dá)或者突變，會導(dǎo)致HGF/c-Met信號通路異常活化，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移[1-4]。因此有效抑制異樣活化的HGF/c-Met信號通路，可以改變腫瘤的狀態(tài)、抑止腫瘤的增長、并使腫瘤的侵襲能力減弱。因此HGF/c-Met的靶點(diǎn)治療藥物紛紛被研究，包括抗體、拮抗劑、小分子抑制劑等等。LS-177是一種4-（2-氟苯氧基）喹啉衍生物，是基于foretinib 的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)并合成的一種小分子抑制劑[5]。在對c-Met激酶及A549、H460、HT-29、MKN-45、SMMC-7721和U87MG 6個典型癌癥細(xì)胞系進(jìn)行體外活性篩選的研究中發(fā)現(xiàn)，LS-177抑制c-Met的IC50值是0.59 nmol·L-1，被認(rèn)為是具有許多靶點(diǎn)受體的酪氨酸激酶抑制劑[6]。在對LS-177的理化性質(zhì)進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)，LS-177在水及油中的溶解性均較差，限制了其液體制劑方面的發(fā)展，選擇將其做成口服制劑，在進(jìn)行l(wèi)S-177口服制劑開發(fā)前，對于LS-177的口服生物利用度的考察至關(guān)重要，且本文是對比格犬血漿中LS-177的含量測定方法的首次報道。本研究建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法定量檢測不同給藥途徑后比格犬的血漿質(zhì)量濃度，并測定LS-177在比格犬體內(nèi)的口服生物利用度，為LS-177口服制劑的開發(fā)提供數(shù)據(jù)支持。

1 儀器與材料

YKH-Ⅱ渦旋混合器（江西醫(yī)療器械廠），液相色譜系統(tǒng)為ACQUITY UPLC (ACQUITY UTRA PERFORMANCE LCTM，Waters Corp，Milford，MA，USA），MS/MS系統(tǒng)為Waters TQ Detector（配備電噴霧離子源，美國Waters公司)， FA-1140電子分析天平（上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司），LG16-C高速離心機(jī)（北京雷勃爾離心機(jī)有限公司），HC-3018R高速冷凍離心機(jī)（中科中佳儀器有限公司）。

LS-177（批號 20140910，沈陽藥科大學(xué)藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室），肝素鈉 （天津生物化學(xué)制藥廠），氯雷他定（原料藥，沈陽藥科大學(xué)藥物制劑實(shí)驗(yàn)室贈），甲醇、甲酸、乙腈（色譜純，飛世爾科技有限公司），甲基叔丁基醚（色譜純，天津博迪化工有限公司），娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司），空白比格犬血漿（沈陽藥科大學(xué)）。

2 方法與結(jié)果

2.1 UPLC-MS/MS方法的建立

2.1.1 溶液的制備

LS-177儲備溶液制備：精密稱取LS-177 2 mg置于200 mL量瓶中，用甲醇配制成10 mg·L-1的儲備液。

LS-177標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備：取適量上述儲備液用甲醇稀釋成5 000、2 500、1 000、500、250和100 μg·L-1的系列溶液，取250 μg·L-1溶液適量，用甲醇稀釋成50、10、2.5 μg·L-1的系列溶液，冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

內(nèi)標(biāo)溶液的制備：精密稱取氯雷他定6.5 mg置于100 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，取出1 mL置于100 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，即得650 μg·L-1的內(nèi)標(biāo)液，冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 血漿樣品的處理

2.1.2.1 靜脈推注給藥后比格犬血漿樣品的處理

向100 μL血漿樣品中加入內(nèi)標(biāo)溶液及甲醇各20 μL，渦旋1 min，混合均勻。加入甲基叔丁基醚3 mL，渦旋萃取10 min，5 000 r·min-1離心5 min。吸取上清液2 mL置于空白5 mL EP管中，40 ℃下氮?dú)獯蹈?，加入甲?00 μL渦旋10 min將吹干樣品復(fù)溶，12 000 r·min-1冷凍離心10 min，吸取上清液進(jìn)樣。

2.1.2.2 經(jīng)口給藥的比格犬血漿樣品的處理

向500 μL血漿樣品中加入內(nèi)標(biāo)溶液及甲醇各20 μL，渦旋1 min，混合均勻。加入甲基叔丁基醚4 mL，渦旋萃取10 min，5 000 r·min-1離心5 min。吸取上清液3 mL置于空白5 mL EP管中，40 ℃下氮?dú)獯蹈?，加入甲?00 μL渦旋10 min將吹干樣品復(fù)溶，12 000 r·min-1冷凍離心10 min，吸取上清液進(jìn)樣。

2.1.3 色譜及質(zhì)譜條件

2.1.3.1 色譜條件

ACQUITYTM UPLC色譜系統(tǒng)（Waters Corp，Milford，MA，USA）；Phenomenex C18色譜柱（50 mm×2.1 mm.，2.6 μm）；柱溫：40 ℃； 樣品室溫度：10 ℃；流動相：A為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸乙腈溶液，B為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫，洗脫條件見表1；進(jìn)樣量：5 μL。

Table 1 Gradient condition of UPLC表1 超高效液相洗脫方法

2.1.3.2 質(zhì)譜條件

Waters ACQUITYTM TQD三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（Waters Corp.， Manchester，UK）；電噴霧離子接口（ESI）；ESI源正離子電離方式；毛細(xì)管電壓2.0 kV；錐孔電壓和提取電壓分別為35 V和30 V；源溫和去溶劑化溫度分別為100和400 ℃；去溶劑氣（氮?dú)猓┝魉?50 L·h-1；錐孔氣（氮?dú)猓┝魉?0 L·h-1；碰撞氣（氬氣）流速0.18 mL·min-1；定量模式為多重反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；用于定量分析的離子反應(yīng)：m/z 727.96→m/z 112.13 (LS-177)；m/z 383.18→m/z 337.13 (氯雷他定)。LS-177和內(nèi)標(biāo)氯雷他定［M+H］+的產(chǎn)物離子全掃描質(zhì)譜圖見圖1，LS-177和內(nèi)標(biāo)氯雷他定的化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖2。

Fig. 1 MS-MS spectra of ［M+H］+ions of LS-177 (A) and internal standard loratadine (B)圖1 LS-177及氯雷他定子離子質(zhì)子掃描圖

Fig. 2 Chemical structure of LS-177(1) and loratadine(2)圖2 LS-177(1)及氯雷他定(2)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

2.1.4 專屬性試驗(yàn)

取6只試驗(yàn)用比格犬的混合空白血漿100 μL，不加內(nèi)標(biāo)溶液，后續(xù)操作按“2.1.2.1”條進(jìn)行，處理后進(jìn)樣5 μL，色譜圖見圖3A；向空白血漿中加入已知濃度的LS-177標(biāo)準(zhǔn)溶液及氯雷他定溶液，后續(xù)操作按“2.1.2.1”條進(jìn)行，處理后進(jìn)樣5 μL，色譜圖見圖3B。LS-177和氯雷他定的保留時間分別為1.85和2.01 min。取比格犬靜注血漿樣品按“2.1.2.1”條操作，色譜圖見圖3C。由圖3A可知，定量檢測LS-177和氯雷他定的2個通道中，對于放大的色譜圖中主藥及內(nèi)標(biāo)的出峰位置信噪比小于3，均未達(dá)到主藥以及內(nèi)標(biāo)的檢測限，可知比格犬空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾LS-177和氯雷他定的測定。

Fig. 3 Representative SRM chromatograms of LS-177 (channel a) and IS loratadine (channel b) in beagle dog plasma圖3 超高液相色譜法專屬性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備與定量下限的確定

2.1.5.1 靜脈給藥血漿測定方法LS-177標(biāo)準(zhǔn)曲線

向100 μL空白血漿中加入LS-177標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL，分別配制成LS-177的血漿質(zhì)量濃度為2、10、50、200、500、1 000和2 000 μg·L-1的樣品，不加甲醇繼續(xù)按“2.1.2.1”條操作，記錄色譜圖。以LS-177質(zhì)量濃度（ρ）為橫坐標(biāo)，LS-177與氯雷他定峰面積比值為縱坐標(biāo)，選用加權(quán)（W=1/X2）最小二乘法進(jìn)行線性回歸，所得LS-177的典型回歸方程如下：Y=0.486 888ρ+10.771 6，r=0.995 0，結(jié)果可知LS-177的血漿質(zhì)量濃度在2～2 000 μg·L-1內(nèi)線性良好。

2.1.5.2 經(jīng)口給藥血漿測定方法LS-177標(biāo)準(zhǔn)曲線

向500 μL空白血漿中加入LS-177標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL，分別配制成LS-177的血漿質(zhì)量濃度為0.1、0.4、2、10、40、100、200和400 μg·L-1的樣品, 不加甲醇繼續(xù)按“2.1.2.2”條操作，記錄色譜圖。計(jì)算方法同“2.1.5.1”條， LS-177典型回歸方程如下：Y=0.852 661ρ+3.712 35，r=0.996 0，結(jié)果可知LS-177的血漿質(zhì)量濃度在0.1～400 μg·L-1內(nèi)線性良好。

2.1.5.3 定量下限的確定

按“2.1.5.2”條操作，配制LS-177血漿質(zhì)量濃度為0.1 μg·L-1的樣品，在方法學(xué)考察的第1天進(jìn)行6個樣品分析，代入當(dāng)天的標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算每個樣品的實(shí)測質(zhì)量濃度，經(jīng)計(jì)算RSD為9.26%。結(jié)果可知利用UPLC/MS/MS法測定血漿中的LS-177的定量下限為0.1 μg·L-1。

2.1.6 精密度與準(zhǔn)確度試驗(yàn)

按“2.1.2”條2種方法分別配制成LS-177血漿質(zhì)量濃度為4.0、100.0、1600.0 μg·L-1和 0.2、20.0、320 .0 μg·L-1的質(zhì)控樣品，各質(zhì)量濃度分別進(jìn)行6樣品分析，連續(xù)進(jìn)行3 d的測定，代入當(dāng)天的回歸方程，求算QC樣品的實(shí)測質(zhì)量濃度，計(jì)算準(zhǔn)確度與精密度，結(jié)果見表2 。

Table 2 Accuracy and precision of UPLC-MS/MS method for determination of LS-177 in plasma samples表 2 超高效液相質(zhì)譜連用法測定LS-177血漿質(zhì)量濃度的精密度與準(zhǔn)確度

2.1.7 提取回收率試驗(yàn)

將血漿的上清液全部取出，剩余其他均按“2.1.2”條2種方法操作，分別配制成LS-177血漿質(zhì)量濃度為4.0、100.0、1600.0 μg·L-1和0.2、20.0、320 .0 μg·L-1的質(zhì)控樣品，各質(zhì)量濃度分別進(jìn)行6樣品分析。

再取100 μL和500 μL空白血漿，不加甲醇及內(nèi)標(biāo)，將萃取上清液全部取出，并將相應(yīng)質(zhì)量濃度的LS-177溶液和氯雷他定溶液加至上清液中，其他按“2.1.2”條操作，進(jìn)樣分析。

同一質(zhì)量濃度樣品經(jīng)上述2種方法處理后得到的峰面積做比值計(jì)算，提取回收率結(jié)果見表3。

Table 3 Recovery of LS-177 and internal standard (Loratadine) using different processing methods of plasma表3 不同血漿處理方法下LS-177及內(nèi)標(biāo)的回收率

2.2 雙周期交叉實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

取健康雄性比格犬6 只，體質(zhì)量為8.00～10.15 kg。給藥方案如下：將試驗(yàn)用禁食12 h后的比格犬，隨機(jī)分為A、B 2組，給予A組比格犬口服LS-177原料藥膠囊（規(guī)格75 mg），B組給與靜脈推注LS-177溶液劑（規(guī)格15 mg），推注時間2 min。經(jīng)過1周的清洗期，進(jìn)行第二周期試驗(yàn)，將A、B組比格犬給藥方式對調(diào)即可。經(jīng)口給藥組于給藥前（0 h）和給藥后0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、24、36、48、72和96 h 靜脈取血2 mL，離心后取血漿1 mL， -40 ℃儲存?zhèn)溆?。靜注組于推注前（0 h）和推注后3、10、15和0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、24、36、48 h 靜脈取血2 mL，離心后取血漿1 mL，-40 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 LS-177體內(nèi)藥物動力學(xué)結(jié)果

2.3.1 血漿藥物質(zhì)量濃度-時間曲線的繪制

試驗(yàn)用比格犬在通過2種給藥方式后，用已建立的UPLC-MS/MS法所測得的LS-177平均血漿質(zhì)量濃度-時間曲線如圖4所示。

Fig. 4 Mean [SD] plasma drug concentration after intravenous and per oral administration of LS-77圖3 比格犬單次口服及靜脈注射LS-177的平均血藥濃度

2.3.2 口服生物利用度的計(jì)算

對LS-177的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，主要的藥物動力學(xué)參數(shù)、用梯形法計(jì)算兩種給藥方式后LS-177的AUC0-t結(jié)果見表4，并根據(jù)口服LS-177和靜注LS-177的AUC0-t計(jì)算LS-177的絕對生物利用度為10.05%。

Table 4 Pharmacokinetic parameters of LS-177 for different administration routes in beagle dogs (n = 6)表4 比格犬不同給藥方式下LS-177的藥物動力學(xué)參數(shù)

3 討論

a. 進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)前對新藥LS-177進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析及溶出度實(shí)驗(yàn)考察，發(fā)現(xiàn)LS-177是屬于分子量大且由多個脂環(huán)構(gòu)成的化合物，體外溶出度差，考慮到其在體內(nèi)的吸收困難，會導(dǎo)致其在血漿中的質(zhì)量濃度過低，因此建立了靈敏度高的超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法，以檢測比格犬體內(nèi)LS-177的質(zhì)量濃度。

b. 對預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)若采用靜注血漿樣品的處理方法對口服血漿樣品進(jìn)行處理，部分口服方式的血漿樣品中的LS-177質(zhì)量濃度低導(dǎo)致檢測不到，需要萃取更多血漿中的LS-177才能準(zhǔn)確定量，而都采用口服血漿樣品處理方法時，由于LS-177存在高濃度抑制作用，使得靜注給藥的高濃度的LS-177血漿樣品不能夠準(zhǔn)確得到定量，增加稀釋溶劑雖可解決此問題但同時也會產(chǎn)生新的系統(tǒng)誤差，所以本研究采用兩種不同的血漿處理方法，建立兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線，精密度及準(zhǔn)確度的結(jié)果均符合方法學(xué)的要求，可證明兩種方法是經(jīng)過驗(yàn)證的并可以分別準(zhǔn)確的定量不同給藥方式比格犬血漿中LS-177的質(zhì)量濃度的。

c. 對LS-177藥物動力學(xué)參數(shù)進(jìn)行分析，靜注和口服方式的 LS-177在比格犬體內(nèi)的半衰期分別為(23.35±44.51)和(26.37±20.53) h，半衰期較長，適合將LS-177做成速釋口服制劑，口服方式LS-177的AUC0-t低，證明LS-177的口服生物利用度低，提高LS-177的口服生物利用度將成為LS-177口服制劑的主要研究目標(biāo)。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用液-液萃取處理血漿樣品的方法對比格犬血漿樣品進(jìn)行處理，并成功建立了UPLC-MS/MS法測定比格犬血漿中的LS-177的質(zhì)量濃度，方法靈敏，準(zhǔn)確度高。分析了不同給藥方式的LS-177的藥動學(xué)參數(shù)，可知LS-177在體內(nèi)的半衰期分別為(23.35±44.51) h（靜注）和(26.367±20.53) h（口服），口服LS-177的達(dá)峰時間為(5.33±4.04) h，峰質(zhì)量濃度為（39.67±32.50）μg·L-1，靜注的LS-177最高的血漿質(zhì)量濃度為3 521.82 μg·L-1，通過梯形法計(jì)算LS-177血漿藥質(zhì)量濃度-時間曲線下面積，經(jīng)計(jì)算靜注方式和口服方式LS-177的AUC0-t分別為（1551.6±646.911）μg·h·L-1和（779.92±453.29）μg·h·L-1，口服的AUC0-t乘以劑量折算系數(shù)與靜脈注射的AUC0-t做比值，經(jīng)計(jì)算的LS-177的絕對生物利用度為10.05%。

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Study in pharmacokinetics of antineoplastic LS-177

ZHANG Jian, ZHENG Qi, WEI Si-jia, TANG Xing, WANG Yan-jiao*
(School of Pharmacy, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, China)

ObjectiveTo set up a quantitative UPLC-MS/MS method of LS-177 in beagles plasma, and to determine the oral bioavailability of LS-177 with this method and provide the scientific data to prepare oral formulation of LS-177.MethodsAccording to the two period cross-over design, beagles were provided different dose of LS-177, then liquid-liquid extraction method was chosen to process the plasma samples and LS-177 was determined by UPLC/MS/MS.ResultsThe LS-177 plasma concentrations calibration curves of UPLC/MS/MS was linear in the range of 0.1-400 and 2-2 000 μg·L-1, and the precision (RSD) and accuracy (RE) were less than 10.38% and 14.71%, respectively. The oral bioavailability of LS-177 was 10.05%.ConclusionUPLC-MS/MS method is established successfully in this study, which is used in pharmacokinetics of LS-177 in beagles. The oral bioavailability of LS-177 is low.

pharmaceutics; pharmacokinetics; UPLC-MS/MS; LS-177

R94

： A

(本篇責(zé)任編輯：趙桂芝)

（2015）05-0173-08

10.14146/j.cnki.cjp.2015.05.003

2015-03-28

張健（1990-），女（漢族），遼寧沈陽人，碩士研究生, E-mail zhangjianjob1@126.com; ＊

：王艷嬌（1968-），女（漢族），遼寧沈陽人，副教授，碩士，碩士生導(dǎo)師，主要從事藥物新劑型及中藥現(xiàn)代化研究，Tel. 024-23986343，E-mail wang53k2002@163.com。