郭 辰，畢婷婷，陳世杰，趙曉紅,*，劉 濤，孫 健

1. 北京聯(lián)合大學功能食品科學技術研究院，北京 100191 2. 首都師范大學生命科學學院，北京 100048

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大氣細顆粒物對CHO細胞的損傷作用及天然物質的拮抗機制

郭 辰1，畢婷婷1，陳世杰1，趙曉紅1,*，劉 濤2，孫 健1

1. 北京聯(lián)合大學功能食品科學技術研究院，北京 100191 2. 首都師范大學生命科學學院，北京 100048

PM2.5引起的健康危害日益受到廣泛關注，但其確切的損傷機理仍不完全清楚，目前也缺乏有效拮抗PM2.5損傷的天然活性物質。因此本文對北京市PM2.5造成CHO細胞的損傷作用及天然物質的拮抗作用進行研究，結果可為PM2.5污染治理和疾病的預防提供科學依據(jù)。通過CCK-8法測定細胞存活率；通過流式細胞儀測定細胞凋亡；用熒光探針DCFH-DA法測定ROS；提取細胞內(nèi)總蛋白并測定其中SOD含量；以及通過Western Blot法分別測定了p-akt/akt、p65及Bad的相對表達量。結果顯示：(1)10～40 μg·mL-1的PM2.5可明顯降低CHO細胞存活率，并呈現(xiàn)極顯著的劑量-效應關系(r=-0.964，P<0.01)；15 μg·mL-1PM2.5可以顯著增加細胞凋亡、引起細胞內(nèi)ROS增加、SOD含量下降；p-akt/akt、p65表達量增加說明Akt通路與NF-κB通路均被激活。(2) 20 μmol·L-1阿魏酸、50 μmol·L-1綠原酸和10 μmol·L-1葒草素預處理可拮抗PM2.5引起的細胞存活率下降以及細胞凋亡率增加，同時降低細胞內(nèi)ROS并增加SOD含量，下調p-akt/akt、p65及Bad的相對表達量。其中20 μmol·L-1阿魏酸的保護作用最佳。結果說明，PM2.5引起的CHO細胞損傷與細胞凋亡與Akt和NF-κB通路的激活有關；三種天然活性物質具有拮抗PM2.5造成的細胞損傷的能力，其保護機理是通過其降低PM2.5引起的細胞內(nèi)氧化應激反應，進而降低被PM2.5激活的Akt通路與NF-κB通路和下調Bad蛋白表達量來實現(xiàn)的。

細顆粒物(PM2.5)；天然活性物質；細胞毒性；氧化應激；Akt信號通路；NF-κB信號通路；Bad蛋白

環(huán)境污染引起的損害作用近年來受到越來越多的關注，國際癌癥研究機構(IARC)已將室外大氣污染列為人類致癌物(I類)[1]。其中大氣顆粒物帶來的健康危害已得到多年流行病學研究的證實。長期PM2.5暴露可引起心血管疾病誘發(fā)的死亡率增加，并且增加呼吸道感染、肺結核、肺癌等呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病率[2-5]，而且當前研究結果未發(fā)現(xiàn)顆粒物的安全閾值，即很低濃度顆粒物也可造成一定的健康危害[6]。PM2.5粒徑小，比表面積大，可吸附環(huán)境中多種成分，如金屬、有機物質以及內(nèi)毒素等[7-8]。超小粒徑還可使PM2.5進入下呼吸道，造成嚴重的健康威脅[6-9]。

對顆粒物損傷機理的研究發(fā)現(xiàn)，顆粒物毒性作用的機制主要包括引起細胞發(fā)生氧化應激反應，并引起炎性因子表達量增加，進而對細胞內(nèi)DNA產(chǎn)生毒性作用，最終導致細胞凋亡或死亡[10]。在這一過程中，多條信號通路發(fā)揮了重要的調控作用。由PM2.5引起的細胞內(nèi)活性氧類(Reactive Oxygen Species, ROS)的增加可激活多條信號通路，如NF-κB、PI3K/Akt、MAPK通路等，它們本身在細胞的生長、凋亡、細胞周期的調控中具有關鍵作用，而這些通路的激活又可介導細胞內(nèi)炎癥因子的釋放，進而造成損傷[11-14]。另外，細胞內(nèi)一些蛋白的功能也受到信號通路的調控。Bad蛋白是是Bcl-2蛋白家族中的促凋亡蛋白，是Akt的下游靶點之一，對細胞凋亡具有重要的調控作用[15-18]。當前針對顆粒物的損傷機理研究主要集中于其造成的氧化損傷與炎性因子表達增加，而對促凋亡蛋白在其中的作用機制研究較少。因此本實驗在關注PM2.5引起的細胞損傷外，還研究了其對Bad蛋白表達變化的影響。

雖然流行病學與毒理學研究證實了PM2.5可引起嚴重的健康危害，其相關機理的研究也是當前研究熱點，但一些天然物質是否可以拮抗顆粒物造成的毒性，相關研究仍十分缺乏。本實驗室在前期的研究中發(fā)現(xiàn)竹葉提取物具有拮抗PM2.5引起的TNF-α分泌、自由基形成、DNA鏈斷裂、細胞凋亡及Akt與NF-κB信號通路激活的作用[18]。對提取物分析結果表明它的主要活性成分為酚酸類和碳苷類。其中有代表性的單體物質阿魏酸和綠原酸，因其抗氧化性，對多種物質引起的細胞毒性具有保護作用[19-22]，其中動物實驗發(fā)現(xiàn)，阿魏酸對于糖尿病晚期造成的大鼠睪丸損傷具有保護作用，并且其保護機制是通過調節(jié)大鼠體內(nèi)TGF-β1、IL-1β，并且與激活Akt通路有關[23]。葒草素對過氧化氫引起的SH-SY5Y細胞凋亡中具有保護作用，因而可能具有神經(jīng)保護功效[24]，另外，很多被證實具有保護作用植物提取物中均發(fā)現(xiàn)葒草素的存在[25-26]。因此，阿魏酸、綠原酸和葒草素可能對顆粒物引起的細胞損傷也具有一定的保護作用。在對顆粒物損傷機理研究的基礎上，加大對具有拮抗其健康危害的物質的研究，更具有現(xiàn)實意義。因此，本文在對北京城區(qū)大氣細顆粒物對CHO細胞毒性作用及機制研究的基礎上，研究阿魏酸、綠原酸和葒草素對PM2.5造成的細胞毒性是否具有保護作用，以及其保護作用是否與其抗氧化性相關；Akt通路與NF-κB通路在其中的作用以及促凋亡蛋白Bad的變化也同時被研究。

1 材料和方法(Materials and methods)

1.1 實驗儀器與試劑

1.1.1 實驗細胞

中國倉鼠卵巢細胞(CHO, Chinese hamster ovary cell)購自中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所北京協(xié)和醫(yī)學院基礎學院細胞中心。

1.1.2 PM2.5樣品采集和前處理

2012年冬季采暖季期間于北京市朝陽區(qū)中國環(huán)境科學研究院2號樓樓頂進行采樣，使用PM2.5撞擊式中流量顆粒物采樣器，流量為78 L·min-1，采樣濾膜為活化后的直徑90 mm的石英膜，24 h換膜循環(huán)采樣。

采用超聲振蕩法洗脫附著在石英膜上的細顆粒物，洗脫液用8層紗布過濾以除去濾膜纖維，濾液真空冷凍干燥。干燥后稱重，并用滅菌的PBS配制成2000 μg·mL-1染毒儲存液，于-20℃避光保存?zhèn)溆?。實驗前需將儲存液溶解備用，染毒前超聲處?5 min以防止PM2.5顆粒聚集。

1.1.3 實驗儀器

CO2培養(yǎng)箱(Sanyo，日本)，超凈工作臺(Baker，德國)，5840R冷凍離心機(Eppendorf，德國)，多功能酶標儀(BIO-TEK，美國)，F(xiàn)ASCailbur流式細胞儀(BD，美國)，聚丙烯酰胺凝膠電泳儀和蛋白電泳轉移裝置(BIO-RAD，美國)，ImageQuant RT ECL凝膠成像系統(tǒng)(GE，美國)。

1.1.4 主要試劑

綠原酸(分析純)、阿魏酸(分析純)、葒草素(分析純) (Sigma，美國)；CCK-8檢測試劑盒(同仁，日本)；細胞凋亡檢測試劑盒(建成生物工程研究所，南京)；ROS檢測試劑盒、總SOD檢測試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天，江蘇)；p-akt單克隆抗體、akt多克隆抗體和p65多克隆抗體(CST，美國)；Bad多克隆抗體(Abcam，美國)；β-actin多克隆抗體和辣根過氧化物酶標記的二抗(博奧森，北京)；SuperECL Plus Western Blot超敏發(fā)光液(Genview，美國)。

1.1.5 PM2.5中金屬元素含量的測定

以洗脫下來的顆粒物為研究對象，委托北京大學公衛(wèi)學院中心儀器室對PM2.5中Cr等16種金屬元素含量進行測定。采用電感耦合等離子體質譜儀(ICP-MS)和電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP-OES)進行測定。

1.1.6 植物活性單體物質配制

將阿魏酸、綠原酸、葒草素和異葒草素四種單體物質用DMSO配制成800 mmol·L-1儲存液，避光保存在4℃，使用前用培養(yǎng)基稀釋至相應濃度。

1.2 細胞存活率的測定

將指數(shù)期細胞按6×103/mL的細胞密度接種于96孔培養(yǎng)板，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后加入不同濃度待測樣品并設平行孔，藥物作用一定時間后，棄去上清，加CCK-8檢測試劑(同仁)，繼續(xù)培養(yǎng)2～4 h后測定450 nm下吸光度值。細胞存活率按公式(1-1)計算。

將指數(shù)期細胞按5×104/mL的細胞密度接種于6孔培養(yǎng)板，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后加入不同濃度待測樣品并設平行孔，藥物作用一定時間后，棄去上清將細胞消化下來后按照細胞凋亡檢測試劑盒說明書(南京建成)依次加入AnnexinV-FITC及PI檢測液，避光孵育。在流式細胞儀上進行檢測。實驗結果通過CellQuestPro軟件直接分析得到。

1.4 細胞內(nèi)ROS的測定

細胞培養(yǎng)及前處理方法同1.3中，細胞消化下來后按照ROS檢測試劑盒說明書(普利萊)加載DCFH-DA探針。孵育一定時間后在流式細胞儀上進行檢測。實驗結果通過CellQuestPro軟件直接分析得到。

1.5 細胞內(nèi)總SOD的測定

培養(yǎng)皿中細胞生長至約80%時，加入不同的藥物處理。處理時間結束后，消化細胞并提取總蛋白。按照總SOD檢測試劑盒說明書(碧云天)對SOD含量進行測定，用BCA蛋白濃度測定試劑盒(鼎國昌盛)測定總蛋白含量，并按照說明書上方法計算酶活力與蛋白含量的比值(U·mg-1pro)。

1.6WesternBlot測定蛋白表達量

按照1.5中的方法提取細胞內(nèi)總蛋白，并測定總蛋白含量，其余樣品加入上樣緩沖液，并立即煮沸5min，使蛋白變性，放入-80℃冰箱保存。電泳時上樣量為40μg蛋白，采用12%的凝膠。電泳結束后將蛋白轉移至PVDF膜，轉膜結束后用5%脫脂奶粉封閉(TBST配制) 1h，加入一定比例的一抗稀釋液，4℃孵育過夜。加入一定比例的二抗稀釋液，室溫避光孵育2h。加入顯色液使用ImageQuantRTECL凝膠成像系統(tǒng)顯影。用QuantityOne軟件分析得到蛋白條帶灰度值，用于統(tǒng)計分析。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

通過SPSS17.0統(tǒng)計軟件對實驗結果進行統(tǒng)計分析，結果均采用Mean±SD表示，兩組均數(shù)比較采用t檢驗，不同樣品濃度與對照組比較采用單因素方差分析法。

2 結果(Results)

2.1 PM2.5中金屬含量檢測結果

使用ICP-MS和ICP-OES法對PM2.5洗脫物中Cr等16種金屬元素的含量進行定量檢測，結果如表1所示。其中，K、Ca、Mg、Zn、Al和Fe的含量較高，為主要金屬組成物，除此之外，Pb的含量也較高。

表1 PM2.5中金屬元素的含量

2.2 不同濃度PM2.5對細胞存活率的影響以及天然活性單體的保護作用

通過CCK-8法首先測定不同濃度的PM2.5對CHO細胞存活率的抑制作用，及不同濃度的天然活性單體物質的保護作用，結果見圖1。圖1 A中結果顯示，不同濃度的PM2.5均能顯著抑制細胞存活率，并顯示出劑量效應關系(r=-0.964，P<0.01)。15 μg·mL-1的PM2.5處理細胞24 h后存活率為72%，30g·mL-1時細胞存活率降至約40%，顯示出較高的毒性。因此，選擇15 μg·mL-1作為PM2.5損傷濃度進行后續(xù)試驗。

不同濃度的阿魏酸(FA)預處理CHO細胞(圖1 B)，觀察其對15 μg·mL-1PM2.5對細胞毒性的拮抗作用，結果顯示10 μmol·L-1和20 μmol·L-1的阿魏酸預處理細胞對由PM2.5引起的細胞存活率下降具有保護作用，使細胞存活率從70%提升至約85%，與PM2.5組比較具有顯著性差異(P<0.01)。而40 μmol·L-1和60 μmol·L-1的阿魏酸預處理反而使細胞存活率進一步降低，表明較高濃度下阿魏酸也對細胞有一定的毒性作用。葒草素(ORI，圖1 C)和綠原酸(CA，圖1 D)預處理也得到類似結果結果，實驗發(fā)現(xiàn)不同濃度葒草素預處理對PM2.5引起的細胞毒性的保護作用也與其濃度直接相關，10～40 μmol·L-1的葒草素預處理可拮抗PM2.5造成的損傷，其中，10 μmol·L-1葒草素預處理保護效果最好，使細胞存活率提升至約80% (P<0.05)。10 μmol·L-1至50 μmol·L-1的綠原酸預處理也可增加細胞拮抗PM2.5的能力，其中50 μmol·L-1保護效果最佳，細胞存活率較之損傷組可提升至82% (P<0.01),而100 μmol·L-1的綠原酸保護效果不明顯。由此可見，在一定的劑量范圍內(nèi)三種物質均可以拮抗PM2.5引起的細胞損傷，即保護作用與劑量相關。三種物質中FA保護效果最為顯著，其次是CA。最終選擇20 μmol·L-1FA；10 μmol·L-1ORI以及50 μmol·L-1CA作為保護劑量，拮抗PM2.5造成的細胞損傷并對其保護機制進行深入研究。

2.3 PM2.5引起CHO細胞凋亡增加及天然活性單體的保護作用

通過Annexin V-FITC/PI雙染法，用流式細胞儀檢測細胞凋亡，在凋亡結果圖中，左下象限表示正常細胞；右下象限為早期凋亡細胞；右上象限為中晚期凋亡及死亡細胞；左上象限則為壞死細胞。總凋亡率以右下象限和右上象限細胞數(shù)之和所占的比例表示。結果顯示，與對照組比較15 μg·mL-1PM2.5作用20 h可明顯增加細胞凋亡率(P<0.01)，而阿魏酸、綠原酸、葒草素預處理6 h后對由PM2.5造成的細胞凋亡增加具有明顯的拮抗作用，其中，20 μmol·L-1的阿魏酸保護效果最好。結果說明，三種天然單體物質在保護劑量下可以明顯拮抗由PM2.5引起的細胞凋亡增加。

2.4 PM2.5引起了細胞內(nèi)氧化應激反應及天然活性單體的拮抗作用

報道顯示，PM2.5引起的細胞損傷與其可引起氧化損傷直接相關，因此，為探究PM2.5對CHO細胞造成損傷的機制及三種天然單體物質的拮抗作用的機制，在CHO細胞經(jīng)過6 h的預處理后及PM2.5染毒后，給細胞加載DCFH-DA探針，并通過流式細胞儀檢測細胞內(nèi)ROS的含量并計算其熒光強度，結果如圖3所示。圖3中M1門表示正常細胞，M2門表示陽性細胞，即ROS含量較多的細胞，右圖是對ROS熒光強度進行統(tǒng)計分析得到的結果。另外，實驗還同時測定了細胞內(nèi)SOD含量(圖4)的變化。細胞內(nèi)ROS的增多說明氧引起了細胞內(nèi)氧化應激反應，反之，SOD含量較多則說明細胞抗氧化能力較強。

圖1 PM2.5及天然活性物質對CHO細胞存活率的影響

注：A，不同濃度的PM2.5作用CHO細胞24 h后，用CCK-8法檢測細胞存活率，與空白組比較，**P<0.01。B，不同濃度的阿魏酸預處理CHO細胞6 h后，再加入15 μg·mL-1的PM2.5繼續(xù)處理細胞20 h后，用CCK-8法檢測細胞存活率；C，不同濃度葒草素預處理CHO細胞6 h后，再加入15 μg·mL-1的PM2.5繼續(xù)處理細胞20h，用CCK-8法檢測細胞存活率；D，不同濃度的綠原酸預處理CHO細胞6 h后，再加入15 μg·mL-1的PM2.5繼續(xù)處理細胞20 h，用CCK-8法檢測細胞存活率。與PM2.5損傷組比較，*P<0.05，**P<0.01。各實驗組n=6。

Note：A, the cell viability was detected by CCK-8 assay after CHO cells were exposed to a series concentrations of PM2.5.Compared to control, *P<0.01. B, after pretreatment with FA for 6 h, 15 μg·mL-1PM2.5was added and incubated for 20 h. C, after pretreatment with ORI for 6 h, 15 μg·mL-1PM2.5was added and incubated for 20 h. D, after pretreatment with CA for 6 h, 15 μg·mL-1PM2.5was added and incubated for 20 h. Compared to PM2.5treated group, *P<0.05,**P<0.01.

如圖所示，空白組細胞(綠色)的峰值出現(xiàn)于M1內(nèi)，在M2內(nèi)含量極少，說明正常細胞內(nèi)ROS含量較低，分析結果顯示，其平均熒光密度為217.94。細胞經(jīng)PM2.5處理20 h后，細胞內(nèi)ROS含量明顯增加，M2內(nèi)出現(xiàn)明顯的峰(黃色)且峰值偏右，說明熒光強度較大，為734.91。而三種單體物質預處理細胞后，均可明顯降低細胞內(nèi)ROS含量，其中保護作用最明顯的為20 μmol·L-1的阿魏酸，熒光強度為340.12，其次分別是綠原酸和葒草素。

與ROS增高相應的，細胞內(nèi)SOD含量在經(jīng)PM2.5處理后顯著降低，進一步說明PM2.5造成了細胞發(fā)生氧化損傷，而三種天然活性單體加入后，細胞內(nèi)SOD水平明顯增高，并且阿魏酸的保護作用最明顯，其次分別是綠原酸和葒草素。結果說明，天然活性單體物質具有拮抗PM2.5造成的細胞氧化損傷的能力，其作用與增加細胞內(nèi)SOD水平，清除ROS有關。

圖2 PM2.5引起細胞凋亡增加以及天然活性單體的拮抗作用Fig. 2 PM2.5caused an increase in cell apoptotic rate and the antagonistic effects from natural active monomers注：a: Control; b: 15 μg·mL-1PM2.5; c: FA 10 μmol·L-1+15 μg·mL-1PM2.5; d: CA 50 μmol·L-1A +15 μg·mL-1PM2.5; e: ORI 10 μmol·L-1+15 μg·mL-1PM2.5. 不同濃度的阿魏酸、綠原酸、葒草素預處理6 h后，再加入15 μg·mL-1的PM2.5繼續(xù)處理細胞20h，用Annexin V-FITC/PI法檢測細胞凋亡。左圖是細胞凋亡的檢測結果，右圖是對結果進行的統(tǒng)計分析。與空白組比較，**P<0.01；與PM2.5損傷組比較，##P<0.01；n=3。Note: a: Control; b: 15 μg·mL-1PM2.5; c: FA 10 μmol·L-1+15 μg·mL-1PM2.5; d: CA 50 μmol·L-1A +15 μg·mL-1PM2.5; e: ORI 10 μmol·L-1+15 μg·mL-1PM2.5.after pretreatment with FA, CA ORI for 6h respectively, 15 μg·mL-1PM2.5 was added and incubated for 20h. Annexin V-FITC/PI assay was employed to detect the cell apoptosis, the left figure is the result detected by flow cytometer and the other is the analysis result.Compared to control,**P<0.01, compared to PM2.5treated group,##P<0.01.

圖3 PM2.5引起細胞ROS增加以及天然活性單體的拮抗作用Fig. 3 PM2.5caused an increase intracellular ROS and the antagonistic effects from natural active注：不同濃度的阿魏酸、綠原酸、葒草素預處理6 h后，再加入15 μg·mL-1的PM2.5繼續(xù)處理細胞20 h，用DCFH-DA法檢測細胞內(nèi)ROS含量。左圖是ROS檢測結果，右圖是對結果進行的統(tǒng)計分析。結果與空白組比較，**P<0.01；與PM2.5損傷組比較，##P<0.01；n=3。Note: After pretreatment with FA, CA, ORI for 6 h respectively, 15 μg·mL-1PM2.5was added and incubated for 20 h. DCFH-DA probe was used to detect intracellular ROS. the left figure is the result detected by flow cytometer and the other is the analysis result.Compared to control,**P<0.01, compared to PM2.5treated group,##P<0.01.

圖4 PM2.5引起細胞SOD含量降低以及天然活性單體的拮抗作用

注：不同濃度的阿魏酸、綠原酸、葒草素預處理6 h后，再加入15 μg·mL-1的PM2.5繼續(xù)處理細胞20h，提取蛋白病測定細胞內(nèi)SOD含量。結果與空白組比較，**P<0.01；與PM2.5損傷組比較，#P<0.05，##P<0.01；n=3。

Fig. 4 PM2.5caused an decrease in superoxide dismutase

(SOD) and the antagonistic effects from natural active

Note: After pretreatment with FA, CA, ORI for 6h respectively, 15 μg·mL-1PM2.5was added and incubated for 20h. the SOD was extracted and enzyme activity was measured. Compared to control, **P<0.01, compared to PM2.5treated group,#P<0.05,##P<0.01.

2.5 PM2.5的損傷機制及天然單體物質的拮抗作用機制

為探究PM2.5的細胞損傷機制及天然活性物質的拮抗作用機制，用Western Blot法分別測定了p-akt，akt，p65及Bad蛋白的表達量。結果如圖5所示，與空白組比較，PM2.5作用一個小時即可顯著增加細胞內(nèi)p-akt/akt、p65蛋白的表達量，說明Akt通路與NF-κB通路被激活，而促凋亡蛋白Bad表達量無顯著變化。三種天然活性物質預處理細胞后，p-akt/akt，p65表達量顯著下降。并且Bad蛋白的表達量與PM2.5處理組比較下降顯著。該結果說明，阿魏酸、綠原酸和葒草素可降低由PM2.5引起的Akt信號通路、NF-κB信號通路的激活以及細胞內(nèi)Bad蛋白的表達量增加。其中，阿魏酸降低p-akt/akt及Bad表達作用最顯著，綠原酸降低p65表達量的作用最顯著。

3 討論(Discussion)

3.1 PM2.5中金屬含量

本研究中所用PM2.5為2012年冬季采暖季期間于北京市北五環(huán)外中國環(huán)境科學研究院收集的樣品，根據(jù)檢測結果，共檢測出16中金屬元素，其中K、Ca、Mg、Zn、Al和Fe的含量較高，為主要金屬元素組成物，同時還檢測出Pb的含量也較高。該結果與來自2008年采集的PM2.5的金屬元素含量比較發(fā)現(xiàn)，本研究所用PM2.5中各個金屬的含量均低于奧運會期間的PM2.5中的金屬含量[27]。值得注意的是，兩次采樣的地點一致，采樣時間不同，而也有諸多報道發(fā)現(xiàn)PM2.5中金屬含量會隨著季節(jié)的變化而改變[28]。但一般情況下，由于北京冬季采暖需求會使燃煤量等增加，導致冬季的PM2.5對健康危害更大，而本實驗中所用PM2.5樣品金屬元素含量低于2008年收集的PM2.5中金屬元素含量，其原因可能是由于前處理中洗脫造成的。本實驗需要將吸附在石英纖維濾膜上的PM2.5顆粒經(jīng)超純水洗脫下來再進行生物測試，該過程可能會造成PM2.5中水溶性的金屬離子的流失[29]。因此大氣中的PM2.5所吸附的金屬離子及其他有害物質可能更多，對健康的危害也更大。

圖5 PM2.5及天然活性單體對細胞內(nèi)蛋白表達量變化的影響作用

注：15 μg·mL-1PM2.5和阿魏酸，綠原酸，葒草素處理同時加入細胞1h后檢測細胞內(nèi)p-akt，akt，p65，Bad蛋白的相對表達量。左圖為Western Blot結果，右圖是對結果進行的統(tǒng)計分析。結果與各個蛋白的空白組比較，**P<0.01；與PM2.5損傷組的p-akt/akt的相對含量比較，△△P<0.01；與PM2.5損傷組p65的蛋白的相對含量比較，□□P<0.01；與PM2.5損傷組的Bad蛋白的相對含量比較, #P<0.05；n=3

Note: FA, CA, ORI and PM2.5 were added and incubated for 1h. western blot was used to measure the p-akt, Akt, p65 and Badprotein expression. Compared to each control, **P<0.01; compared to the PM2.5caused p-akt/aktexpression rate,△△P<0.01; compared to the PM2.5caused p65 expression rate,□□P<0.01; compared to the PM2.5caused Bad expression rate, #P<0.05, n=3.

3.2 PM2.5的細胞毒性

中國倉鼠卵巢細胞(CHO Cells)被廣泛的用于體外毒性檢測中，同時還是OECD推薦的體外遺傳毒性檢測使用的細胞之一[30-31]。

不同來源的PM2.5其組成成分相差較大，所以不同地區(qū)不同時間收集的PM2.5對細胞毒性的影響也不相同。本實驗結果發(fā)現(xiàn)，15 μg·mL-1PM2.5作用24 h后，CHO細胞存活率已降至約70%左右；30 μg·mL-1時細胞存活率將約50%。而早期北京城區(qū)PM2.5對A549細胞存活率的影響作用發(fā)現(xiàn)，25～50 μg·mL-1的PM2.5作用24 h可以促進細胞增殖，400 μg·mL-1的PM2.5處理細胞存活率降至53.304±4.082[32]。另外，Deng等人的研究顯示，25 μg·mL-1的于2009在北京收集到的PM2.5樣品作用于A549細胞，24 h后細胞存活率顯著下降，但仍為90%左右，48 h后存活率下降到約為80%[33]。結果說明，雖然以上實驗中的PM2.5均來自同一地區(qū)，但細胞毒性相差較大，這與作用時間的不同以及細胞本身的差異有關。不同細胞對刺激物的耐受性可能有差別，Corsini等人發(fā)現(xiàn)，相同的PM2.5分別作用于THP-1細胞和A549細胞，結果顯示THP-1細胞對PM2.5更加敏感[11]。另外，即使是同一地區(qū)，但不同的收集時間及收集地點采集到的PM2.5其細胞毒性的差異也可能較大。在荷蘭進行的一項結果發(fā)現(xiàn)，相同濃度下不同采樣點收集的PM2.5對細胞存活率的影響差別較大[34]。PM2.5的細胞毒性受多種因素的影響，并且與其來源與組成緊密相關。本實驗結果發(fā)現(xiàn)，除可抑制細胞存活率外，PM2.5還可引起細胞凋亡增加，類似的作用也早有報道[35-36]。

3.3 PM2.5的損傷機理

對PM2.5損傷機理進行研究發(fā)現(xiàn)，PM2.5的細胞損傷其機理與PM2.5引起細胞氧化損傷有關，并涉及到Akt信號通路和NF-κB信號通路。實驗結果顯示，15 μg·mL-1的PM2.5可顯著增加CHO細胞內(nèi)ROS，并同時降低SOD活力，揭示細胞氧化損傷增加，激活Akt信號通路與NF-κB信號通路，表現(xiàn)為p-akt，p-65蛋白相對表達量顯著增加。正常情況下，Akt、NF-κB等通路的激活有助于促進細胞生長，而當細胞受到外界不良刺激，引起ROS增加，細胞發(fā)生氧化應激反應，也可通過一系列反應上調促存活的信號表達，從而抵御外界損傷。如用PM2.5刺激A549細胞后，細胞內(nèi)ROS引起了PI3K/AKT通路的激活，進而激活了Nrf2通路，增加了ARE下游的Ⅱ相解毒酶、抗氧化蛋白、蛋白酶體/分子伴侶等基因的轉錄和表達以抵抗內(nèi)外界的有害刺激[37]。諸多研究證實了顆粒物作用下Akt、NF-κB信號通路的激活。Watterson等人發(fā)現(xiàn)，BEAS-2B細胞暴露于PM2.5激活了Akt和NF-κB通路，并引起了相關炎性因子表達量的增加[13]。在對顆粒物造成的細胞損傷機制的研究中，NF-κB信號通路是近年來的研究熱點，顆粒物可通過激活NF-κB通路上調白細胞介素-8(IL-8)的表達[12]。此外，顆粒物引起的DNA損傷也與NF-κB信號通路有關[32]。

本實驗還發(fā)現(xiàn)PM2.5使Bad蛋白表達量增加，但作用效果并不明顯。Bad蛋白是Bcl-2蛋白家族中一個促凋亡蛋白，其激活后可促進細胞凋亡。該結果可解釋本實驗中由PM2.5造成的細胞凋亡增加。另外，Bad蛋白也是PI3K/Akt通路的下游靶點，在多種細胞中表達，其可通過細胞信號轉導通路和與caspase家族成員的作用來參與細胞凋亡的全過程[38-39]。一般情況下，Akt通路激活會抑制Bad蛋白的活性，從而起到抗凋亡作用，但本實驗發(fā)現(xiàn)，在Akt通路被PM2.5激活時，Bad的表達增加。說明Bad蛋白的表達還受到其他因素的影響，如MEK、PKA、PKC等激酶[40]。雖然顆粒物對Bad蛋白的影響作用的研究卻很少，但研究發(fā)現(xiàn)，其他Bcl-2家族蛋白可受到顆粒物作用的影響。如PM10暴露的Wistar大鼠15天后，其體內(nèi)bax/bcl-2比例增加[41]，說明顆粒物可通過增加促凋亡蛋白與抗凋亡蛋白的比例對機體造成損傷。另外，研究還發(fā)現(xiàn)前促凋亡蛋白Bim[37]以及抗凋亡蛋白Bcl-xl[38]以及Bax、Bcl-2等[29]的表達也受顆粒物作用的影響[35,42,43]。

3.4 活性物質拮抗PM2.5的作用機制

雖然對于PM2.5的健康危害及機制研究已成為當前研究熱點，然而一些天然物質對其的拮抗作用的相關研究資料卻十分匱乏。早期的一項研究發(fā)現(xiàn)，N-乙酰半胱氨酸(NAC)通過抑制由PM2.5激活的NF-κB信號通路，提高了大鼠的抗氧化能力，并降低了血清和肺組織中炎性因子的表達，對PM2.5造成的大鼠肺損傷具有保護作用[44]。姜薇等人的研究也發(fā)現(xiàn)，番茄紅素可拮抗PM2.5造成的HLF(人肺成纖維細胞)細胞DNA損傷[45]。另外，人參皂苷，維生素E等也被報道可以拮抗顆粒物造成的損傷，其保護機制均與其抗氧化性有關[46-47]。

本實驗中選取了三種天然化合物單體作為拮抗PM2.5造成的損傷的保護劑，分別是阿魏酸、綠原酸和葒草素。結果證實，20 μmol·L-1阿魏酸、50 μmol·L-1綠原酸和10 μmol·L-1葒草素預處理6 h可拮抗PM2.5引起的細胞存活率下降。其中，20 μmol·L-1的阿魏酸保護效果最顯著。在對其保護機理的研究發(fā)現(xiàn)，三種單體通過其抗氧化性，可抑制顆粒物引起的細胞凋亡增加，減少細胞內(nèi)ROS、提高SOD含量以及抑制過度激活Akt和NF-κB通路并減少促凋亡蛋白Bad表達等。與對細胞存活保護效果一致，20 μmol·L-1的阿魏酸在上述方面保護效果最佳，其次是綠原酸，最后是葒草素。

當前對顆粒物的研究熱點多集中于顆粒物造成的健康危害及其損傷機理的研究，而針對一些活性物質所具有的拮抗功能的研究確相對較少。本實驗證實，一些天然活性單體物質可拮抗PM2.5造成的細胞毒性，其保護機理與其抗氧化性相關，因此在對顆粒物的損傷機理研究的基礎上，還應該尋找更多更有效的具有拮抗作用的物質，為預防顆粒物造成的健康危害提供基礎數(shù)據(jù)。

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The Detrimental Effects of PM2.5and the Protective Effects of Bioactive Compounds on CHO Cell

Guo Chen1, Bi Tingting1, Chen Shijie1, Zhao Xiaohong1,*Liu Tao2, Sun Jian1

1. Research Institute for Science and Technology of Functional food, Beijing Union University, Beijing 100191, China 2. School of Life Science, Capital Normal University, Beijing 100048, China

Received 11 April 2014 accepted 26 August 2014

Fine particulate matters (PM2.5) cause health problems that have brought great deal of concern. However, the mechanisms by which PM2.5involved casus detrimental effects and the antagonism of bioactive compounds are still unclearcurrently unknown. The detrimental effects of PM2.5collected in Beijing and the antagonism of Ferulic acid (FA), Chlorogenic acid (CA) and Orientin (ORI) on CHO cell were studied in this research and provided basic information for controlling the air pollution control and the subsequent respiratory diseases. CCK-8 assay was used to detect the cell viability, while cell apoptosis was detected with a Flow Cytometry. The gene expression of p-akt,akt, p65 and Bad were analyzeddetected with a Western Blot analysis. Intracellular ROS and SOD level were measured with the fluorescent probe DCFH-DA and WST-1, respectively. Results showed that 10～40 μg·mL-1PM2.5reduced cell viability in a dose dependent manner (r=-0.964，P<0.01). 15 μg·mL-1of PM2.5dramatically remarkebly reduces the cell viability and as well as SOD level andas well asincreased the apoptotic rate and the intracellular ROS in CHO cells. It also up-regulated the gene expressions of p-akt/akt and p65 which indicated the activation of Akt and NF-κB signaling pathways. Pretreatments with 20 μmol·L-1FA, 50 μmol·L-1CA and 10 μmol·L-1ORI maintained CHO cell viability and reduced PM2.5-induced apoptosisthrough the down-regulate reduction of the intracellular ROS , up-regulated SOD, and the down-regulated p-akt/akt, p65 and Bad. Taking together, PM2.5causes damage on CHO cells through a variety of mechanisms, and the bioactive compounds can attenuated these effects by reducing oxidative stress and the over- up-regulatedinduction of Akt and NF-κB pathways.

fine particulate matter(PM2.5); bioactive compounds; cytotoxicity; oxidative stress(ROS); Aktsignal pathway; NF-κBsignal pathway; Bad protein

北京市教育委員會科技計劃重點項目(KZ201211417041)

郭辰(1988-)，女，研究生，研究方向為毒理學，E-mail: chenpreteen@sina.com

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: xiaohong@buu.edu.cn

10.7524/AJE.1673-5897-20140411001

2014-04-11 錄用日期：2014-08-26

1673-5897(2015)3-101-11

X171.5

A

趙曉紅(1961-)，女，博士，研究員，主要研究方向為環(huán)境與食品毒理學。

郭辰，畢婷婷，陳世杰, 等. 大氣細顆粒物對CHO細胞的損傷作用及天然物質的拮抗機制[J]. 生態(tài)毒理學報，2015, 10(3): 101-111

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