萬力, 宋世震, 樊柏林, 楊文祥, 劉春霞, 唐曉蕎, 孫凡中, 劉瑤,*

1. 武漢科技大學醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院，湖北 武漢 430065 2. 湖北省疾病預防控制中心，應用毒理湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430079

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吡草醚原藥對大鼠一般生長情況的影響及其慢性腎毒性研究

萬力1,2, 宋世震1, 樊柏林2, 楊文祥2, 劉春霞2, 唐曉蕎2, 孫凡中2, 劉瑤2,*

1. 武漢科技大學醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院，湖北 武漢 430065 2. 湖北省疾病預防控制中心，應用毒理湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430079

研究吡草醚原藥對大鼠一般生長情況的影響，尋找慢性毒性靶器官以及確定最大無作用劑量(NOAEL)。將初重為40～50 g的SPF級SD大鼠隨機分成對照、低、中和高劑量組，160只/組，雌雄各半。各組動物分別給予含有不同濃度吡草醚原藥的飼料(0，80，400，2 000 mg·kg-1的飼料)，染毒期間不限制攝食飲水，期限為104周。結(jié)果顯示雌、雄鼠中、高劑量組1～104周的體重、增重、食物利用率與對照組比較，于不同階段均有不同程度降低，差異有顯著性(P <0.05或P <0.01或P<0.001)；中、高劑量受試物可導致大鼠血液中尿素氮(BUN)水平升高及膽堿酯酶(ChE)水平下降，腎臟器系數(shù)升高，與對照組比較差異有顯著性(P<0.05或P<0.01或P<0.001)；病理學檢查顯示中、高劑量組可引起腎小管上皮細胞變性、腎臟間質(zhì)炎、慢性進行性腎病等。實驗結(jié)果表明在本試驗條件下，中、高劑量的吡草醚原藥可明顯影響大鼠的體重增長及食物利用率，對SD大鼠的慢性毒性靶器官是腎臟。

吡草醚；慢性毒性；靶器官

吡草醚是一種新穎的觸殺型除草劑，主要用于麥田防除各種闊葉雜草，對禾谷類作物選擇性高[1]，同時在經(jīng)濟類作物也有應用[2-3]。以水稻和棉花為代表性的這兩類作物在我國的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占很大的比重。隨著我國人口快速地增長，科學地增加作物產(chǎn)物早已成為農(nóng)業(yè)工作者思考的問題，而新型的除草劑也早已投入農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用。

外源化學物本身可與環(huán)境或生物群的相互作用，最終可遷徙或富集于人群接觸到的環(huán)境或食物鏈中[4]。用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的除草劑最終也會以各種代謝形式或劑量被人群接觸[5]，有研究表明吡草醚在環(huán)境中污染小、易降解[6]，但目前國內(nèi)外關于吡草醚嚙齒類動物一般毒性研究資料尚少[7]。本研究小組已對吡草醚展開初步的毒理學研究，但隨著吡草醚在農(nóng)產(chǎn)業(yè)的廣泛應用，促使我們需更進一步對其毒性進行探討。慢性毒性試驗作為毒理學安全性評價的最后也是最關鍵的一個階段，也是新型農(nóng)藥登記必不可少的方面，可為外源化學物一般毒性評價提供較為全面的數(shù)據(jù)。

根據(jù)已有的亞慢性經(jīng)口毒性試驗結(jié)果：最小有害作用劑量(LOAEL)為125.00 mg·kg-1，最大無作用劑量(NOAEL)為31.25 mg·kg-1，本研究小組依據(jù)《GB 15670-1995 農(nóng)藥登記毒理學試驗方法》[9]設計慢性毒性試驗，本文主要從一般生理生化角度對吡草醚的慢性毒性進行分析，本組裴蘭潔等從病理組織學角度對吡草醚的慢性毒性及致癌性進行了分析[8]，共同尋找慢性毒性靶器官及確定NOAEL，為建立該除草劑的安全接觸限值提供依據(jù)。

1 材料和方法(Materials and methods)

1.1 實驗動物及飼養(yǎng)環(huán)境

選用SPF級SD大鼠，雌雄各320只，初重為40～50 g，由上海西普兒-必凱實驗動物有限公司提供，許可證號：SCXK(滬)2008-0016，合格證號：No. 0066915。所有實驗動物飼養(yǎng)于湖北省實驗動物中心SPF級屏障系統(tǒng)內(nèi)，飼喂該中心提供的經(jīng)輻照滅菌的全價營養(yǎng)顆粒飼料。環(huán)境條件：溫度23±3 ℃，濕度40%～70%，明暗交替12 h，噪音在60 dB以下；換氣頻率：10～18次/h。

1.2 儀器及試劑

1.2.1 主要實驗儀器

全自動生化分析儀(日立7020型)，尿液分析儀(優(yōu)利特-100)，TC-120G組織自動脫水機(孝感泰維公司)，萊卡RM2235切片機(萊卡公司)，日本OLYMPUS顯微鏡。

1.2.2 主要試劑

血生化檢測用試劑：上海豐匯醫(yī)學科技有限公司，尿液常規(guī)檢測用試紙條：桂林優(yōu)利特醫(yī)療電子銷售有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1動物分組及劑量設計 共設1個對照組和3個劑量組，所有大鼠隨機分為160只/組，雌雄各半，各組動物所食飼料吡草醚原藥含量分別為0，80，400，2000 mg·kg-1的飼料。

1.3.2 染毒途徑及期限

各劑量組動物采用含定量受試物的飼料連續(xù)104周飼喂染毒，對照組動物飼喂含有相同營養(yǎng)成分的正常飼料，整個期間動物自由攝食飲水。

1.3.3 檢測指標

1～13周每周稱取所有動物體重、攝食量1次，14～104周每4周稱取所有動物體重、攝食量1次；試驗26、52、78周分別取計劃解剖的動物(20只/組，雌雄各半，單性別檢測數(shù)n=10)、104周取各組存活的全部動物(單性別檢測數(shù)n>10)，采集血液做血生化檢測，采集尿液進行尿常規(guī)檢測，，大體解剖稱量臟器計算臟器系數(shù)并進行組織病理學檢查。

1.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

計量資料如體重、進食量、血液生化、臟器重量等指標進行單因素方差分析(ANOVA)，用Dunnett檢驗比較各劑量組同對照組的差異顯著性；動物的臨床癥狀觀察、動物死亡率等計數(shù)資料的統(tǒng)計采用X2檢驗；病理解剖所見、組織學所見采用Fisher確切概率檢驗；數(shù)據(jù)采用SPSS12.0軟件分析(在以下各柱形圖中，**，***分別表示：與對照組相比，P <0.01、P<0.001)。

2 結(jié)果(Result)

2.1 對大鼠體重(Body Weight, BW)及體重增重(Weight gain, WG)的影響

與對照組比較，低劑量組雌雄大鼠的各周BW和0～104周的階段性WG均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；雌鼠中劑量組第2～32周的BW下降，36～104周的BW差異無顯著性(P>0.05)，而0～26周的WG下降(P<0.01)；雌鼠高劑量組1～104周的BW均明顯下降(P<0.01)，各階段WG亦下降明顯(P<0.01)。雄鼠中劑量組1～3周的BW差異有顯著性(P<0.01)，其余各周BW及各階段的WG差異亦無顯著性；雄鼠高劑量組1～104周的BW及各階段的WG均下降，差異有顯著性(P<0.01或P<0.001)。吡草醚對大鼠體重及體重增重的影響，詳情見圖1～4：

2.2 對大鼠食物利用率的影響

與對照組比較，低劑量組雌、雄大鼠有個別周次的食物利用率存在差異，但1～26、1～52、1～78、1～104周的平均食物利用率均未見統(tǒng)計學差異(P>0.05)；中劑量組僅雌鼠部分周的食物利用率及1～26周的平均食物利用率與對照組比較降低，差異有顯著性(P<0.05或P<0.01或P <0.001)；高劑量組雌、雄大鼠部分周的食物利用率及1～26、1～52、1～78周的平均食物利用率與對照組比較均降低，差異有顯著性(P<0.05或P<0.01或P<0.001)。各階段平均食物利用率詳情見表1：

圖1 吡草醚原藥對雌性大鼠體重的影響Fig. 1 Effects on body weight of female rats

圖2 吡草醚原藥對雌性大鼠體重增重的影響Fig. 2 Effects on body weight gain of female rats

圖3 吡草醚原藥對雄性大鼠體重的影響Fig. 3 Effects on body weight of male rats

圖4 吡草醚原藥對雄性大鼠體重增重的影響Fig. 4 Effects on body weight gain of male rats

表1 吡草醚原藥對大鼠平均食物利用率的影響±s)

注：*，**，***分別表示與對照組比較P<0.05，P<0.01，P<0.001； (A)：Average。

Note: Compared with control group,*: P<0.05,**: P<0.01,***: P<0.001; (A)：Average food efficiency.

2.3 對尿液常規(guī)及血液生化的影響

各劑量組26、52、78、104周雌雄動物尿液常規(guī)檢驗與對照組比較差異均無顯著性；與對照組比較，受試物各劑量組對大鼠血漿中谷草轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(AST)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、堿性磷酸酶(ALP)、膽固醇(CHOL)、甘油三酯(TG)、總膽紅素(T-BIL)，在26、52、78、104周分別有不同程度的影響，但不具有確定的毒理學意義；與對照組比較，26周時，雄鼠高劑量組BUN升高(P<0.05)；78、104周時，雌鼠高劑量組BUN均升高(P<0.001)，104周雄鼠中、高劑量組BUN升高(P<0.05，P<0.001)；與對照組比較，僅低劑量組52、104周的雌鼠和78周雄鼠Crea下降(P<0.05)；與對照組比較，高劑量組雌鼠的26、78、104周的ChE均下降(P<0.05，P<0.001)。吡草醚原藥對大鼠血液生化的影響，詳情見表2：

2.4 對腎臟重量和臟器系數(shù)的影響及病理學檢查

中劑量組雌鼠104周腎臟重量，臟器系數(shù)均升高，與對照組比較差異有顯著性(P<0.05)；中劑量組雄鼠26周腎臟器系數(shù)升高(P<0.01)。高劑量組雌鼠52、78、104周腎臟器系數(shù)均升高(P<0.01，P<0.001)；高劑量組雄鼠26、78周腎臟器系數(shù)均升高(P<0.05，P<0.01)；104周病理學檢查顯示中劑量組可引起雌鼠腎臟間質(zhì)炎(見圖5，彩插d)，與對照組比較差異有顯著性(P<0.05)，高劑量可引起雌鼠腎小管上皮細胞變性(見圖5，彩插e)，與對照組比較差異有顯著性(P<0.01)。吡草醚原藥對大鼠腎臟器系數(shù)的影響，詳情見表3：

表2 吡草醚原藥對大鼠血液生化的影響±s)

注：*，**，***分別表示與對照組比較P<0.05，P<0.01，P<0.001。

Note: Compared with control group,*: P <0.05,**: P <0.01,***: P <0.001.

表3 吡草醚原藥對大鼠腎臟重量及臟器系數(shù)的影響±s)

注：*，**，***分別表示與對照組比較P<0.05，P<0.01，P<0.001。

Note: Compared with control group,*: P <0.05,**: P <0.01,***: P <0.001.

a對照組 正常腎臟組織結(jié)構(H.E.×100) b低劑量組 腎小管內(nèi)蛋白管型(H.E.×100)

a Control group normal kidney tissue structure b Low-dose group protein tubes type in kidnet tubules

c中劑量組 腎小管上皮細胞變性(H.E.×100) d中劑量組 腎臟間質(zhì)炎性細胞浸潤(H.E.×100)

c Middle-dose group renal tubular epithelial cells degeneration d Middle-dose group renal interstitial inflammatory cell infiltration

e高劑量組 腎小管上皮細胞變性(H.E.×100) f 高劑量組 腎臟間質(zhì)炎性細胞浸潤(H.E.×100)

e High-dose group Renal tubular epithelial cells degeneration f Middle-dose group renal interstitial inflammatory cell infiltration

圖5 吡草醚原藥慢性毒性試驗104周大鼠腎臟病理學檢查

Fig. 5 Pathologic observation on kidney of rats

3 討論(Discussion)

我國是農(nóng)藥生產(chǎn)以及出口大國，早在2008年，化學農(nóng)藥累計產(chǎn)量為190萬t，其中除草劑為61.6萬t，占32.4%[10]。如此大的產(chǎn)量和使用量，需有規(guī)范的法律來約束。新型農(nóng)藥需要登記后使用是農(nóng)業(yè)部門加強農(nóng)藥管理的有效控制手段之一?；瘜W類除草劑多是長殘留型，有文獻報道目前生產(chǎn)中普遍使用的除草劑中有20%～70%會長期殘留于土壤中，從而使土壤，地下水、糧食受到污染。動物食用除草劑污染的飼料，侵害其肝、腎、消化器官，人類食用受除草劑殘留污染的食品，對健康造成嚴重影響，可以造成腫瘤、腎壞死等[11]。所以對新型除草劑慢性毒性的研究，既有利于農(nóng)藥的管理，也有利于預防該農(nóng)藥引起的疾病。

本試驗對照組動物在整個試驗周期內(nèi)，處于GLP實驗室的管理條件內(nèi)，其體重、食物利用率等一般生理、生化檢測指標均處于良好的質(zhì)控范圍以內(nèi)[12]，可為其他慢性毒性研究的開展提供部分參考。低劑量組大鼠體重較對照組無明顯變化，可推測在低劑量染毒水平下,吡草醚對兩種性別大鼠增重均無明顯影響，但高劑量組動物BW、WG明顯下降，其中雌鼠增重降低較雄鼠更為明顯；中劑量組動物染毒初期BW、WG降低，雌鼠分別于32周及0～26周以前有差異性，雄鼠僅1～3周BW有差異性，提示差異性雌鼠較雄鼠更為明顯。兩種性別中劑量組動物的體重增長均表現(xiàn)出染毒初始階段有差異，后無明顯變化這一特點。同時病理組織學研究亦發(fā)現(xiàn)吡草醚的慢性毒性表現(xiàn)出一定的雌雄差異[8]，這可能與生物體對外源化學物的敏感性和耐受性強弱有關，可推斷雄鼠較雌鼠對吡草醚有較強的耐受性，這也是慢性毒性表現(xiàn)出一定雌雄差異的主要原因。與體重增長相關的食物利用率同樣也表現(xiàn)出高劑量組動物明顯降低以及中劑量組雌鼠染毒初始階段的降低；提示高于中劑量染毒水平之下，兩種性別的大鼠在攝入吡草醚后均產(chǎn)生了一定的生長抑制作用。血液中BUN和Crea水平是目前臨床評價腎功能最常用的指標[13-14]。本次試驗結(jié)果Crea的降低無明顯劑量-反應關系，亦無明確的毒理學意義；根據(jù)26～104周各試驗組共4階段的檢測結(jié)果，大鼠血液中BUN的升高呈現(xiàn)明顯的劑量-反應關系，同時在時間上表現(xiàn)出明顯的慢性進行性升高，提示吡草醚可引起大鼠腎功能慢性進行性改變。臨床上的肝腎功能不全者通常表現(xiàn)出血液中ChE含量升高，本試驗結(jié)果中的ChE下降尚無確實依據(jù)，其下降的原因和機制還有待進一步的試驗論證。各劑量組腎臟重量無明顯差異性，但由于大鼠體重的降低導致中、高劑量組腎臟器系數(shù)升高，并且滿足劑量-反應關系，亦表現(xiàn)出時間上的慢性進行性升高這一特點。通過生理生化結(jié)果可初步了解吡草醚對大鼠的慢性毒性特征，但未能觀察致癌性；本組裴蘭潔等發(fā)現(xiàn)的病理組織學改變?yōu)槟I小管上皮細胞變性、腎臟間質(zhì)炎等，即共同證明：吡草醚的慢性毒性表現(xiàn)出一定的雌雄差異性，腎臟是其主要靶器官。

慢性毒性試驗是毒理學安全性評價的最終同時也是最關鍵階段之一，其目的是尋找因長期接觸外源化學物后可能產(chǎn)生毒效應的器官，但外源化學物的毒效應器官可以是靶器官，也可以是其他器官[15]。通過本次試驗結(jié)果可推斷吡草醚原藥對大鼠慢性毒性靶器官以及效應器官之一是腎臟。計算得出NOAEL為：雌、雄大鼠均為80 mg·Kg-1的飼料，根據(jù)1～104周大鼠體重、攝食量均值計算得出吡草醚原藥每日攝入量NOAEL為：雌性大鼠為7.45 mg·kg-1·d-1，雄性大鼠為5.84 mg·kg-1·d-1，以上數(shù)據(jù)可為建立吡草醚安全接觸限值提供依據(jù)。

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◆

Effect of Pyraflufen-ethyl on Growth and Kidney of Rat

Wan Li1,2, Song Shizhen1, Fan Bolin2, Yang Wenxiang, Liu Chunxia2, Tang Xiaoqiao2, Sun Fanzhong2, Liu Yao2,*

1. School of Public Health，Wuhan University of Science and Technology, Wuhan 430065, China 2. Hubei Provincial Center for Disease Control and Prevention, Hubei Key Laboratory for Applied Toxicology, Wuhan 430079, China

Received 21 Februray 2014 accepted 12 May 2014

To investigate the general effect of pyraflufen-ethyl on rat growth, to discover potential target organs under chronic toxic challenge and determine NOAEL. SPF level SD rats, body weight between 40 to 50 grams, were randomly divided into control, low, middle and high dose groups, 160 rats/group, half male and half female. The rats were fed with forage containing different concentrations of pyraflufen-ethyl for 104 weeks, and had free access for drinking water. It was discovered that compared to the control group, there was significant decrease in body weight、weight gain and food efficiency at different stage in high dosage group (P<0.05); There was significant increase in blood BUN level, kidney weight rate, and decrease in ChE level in middle and high dose group (P<0.05). Histological examination showed degeneration of renal tubular epithelial cells, interstitial nephritis, chronic nephrosis in high dose group. These results demonstrated that middle to high dose of pyraflufen-ethyl inhibits weight gain and food efficiency in rat, and kidney is the target organ of chronic toxicity of the medicine.

pyraflufen-ethyl; chonic toxicity; target organ

萬力(1987-)，男，碩士在讀，研究方向：勞動衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學，E-mail: wanli_cnwh@163.com；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: liuyao20021154@163.com

10.7524/AJE.1673-5897-20140221001

2014-02-21 錄用日期：2014-05-12

1673-5897(2015)3-093-08

X171.5

A

劉瑤(1974-)，女，醫(yī)學碩士，副主任醫(yī)師，主要從事健康相關類產(chǎn)品毒理學研究。

萬力, 宋世震, 樊柏林, 等. 吡草醚原藥對大鼠一般生長情況的影響及其慢性腎毒性研究[J]. 生態(tài)毒理學報，2015, 10(3): 93-100Wan L, Song S Z, Fan B L, et al. Effect of pyraflufen-ethyl on growth and kidney of rat [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(3): 93-100 (in Chinese)