龐傳武安淑紅王昭金*

1.泰山醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室,山東泰安2710002.泰山護(hù)理職業(yè)學(xué)院,山東泰安271000

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P2X2陽性感覺神經(jīng)末梢在小鼠食管的分布

龐傳武1,2,安淑紅1,王昭金1*

1.泰山醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室,山東泰安271000
2.泰山護(hù)理職業(yè)學(xué)院,山東泰安271000

摘要:本文采用免疫熒光組織化學(xué)雙標(biāo)方法結(jié)合激光共聚焦顯微鏡技術(shù)研究了傷害性受體P2X2陽性感覺纖維末梢在小鼠食管內(nèi)的分布及與降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）陽性纖維的關(guān)系。結(jié)果表明：在食管各水平均可見到P2X2陽性感覺纖維末梢。P2X2陽性纖維集中分布于食管的內(nèi)、外肌層之間，部分或全部的覆蓋在肌間神經(jīng)節(jié)的表面。一些串珠樣的纖維深入到肌間神經(jīng)節(jié)內(nèi)，相互纏繞在一起形成許多結(jié)構(gòu)復(fù)雜、形狀各異的神經(jīng)節(jié)內(nèi)板狀末稍（IGLEs）。熒光雙標(biāo)顯示許多CGRP陽性纖維圍繞在P2X2陽性IGLEs周圍，沒有見到P2X2和CGRP在同一纖維的共存。結(jié)狀神經(jīng)節(jié)內(nèi)可見許多中小型神經(jīng)元表達(dá)P2X2，P2X2/CGRP雙標(biāo)神經(jīng)元稀少，而背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)可見較多的P2X2陽性細(xì)胞含有CGRP。由此可見，小鼠食管內(nèi)部分感覺神經(jīng)末梢表達(dá)傷害性受體P2X2，并形成IGLEs樣末梢結(jié)構(gòu)。

關(guān)鍵詞:P2X2受體;神經(jīng)節(jié)內(nèi)板狀末梢;降鈣素基因相關(guān)肽;食管;小鼠

ATP (Adenosine triphosphate，三磷酸腺苷)作為一個(gè)快速突觸傳遞的神經(jīng)遞質(zhì)，其作用可能參與機(jī)體感覺及其他多種不同生理功能的傳遞。ATP受體（Purinergic receptors，嘌呤能受體）P2X，為ATP門控的離子通道受體家族。到目前為止，已經(jīng)克隆出7種不同的P2X受體亞型，每種亞型都具有獨(dú)特的藥理學(xué)特性和組織學(xué)分布特征[1]。免疫組織化學(xué)和原位雜交方法顯示P2X2受體特異地分布于感覺神經(jīng)元胞體及其周圍突[2,3]，其功能可能與傷害性刺激的傳導(dǎo)有關(guān)[4,5]。研究發(fā)現(xiàn)，消化管內(nèi)有來自迷走神經(jīng)和脊神經(jīng)的感覺纖維分布。其中脊神經(jīng)傳入纖維多為游離感覺纖維，而迷走傳入纖維形成神經(jīng)節(jié)內(nèi)板狀末稍（Introganglionic laminar endings，IGLEs）結(jié)構(gòu)[6]。IGLEs是位于消化管內(nèi)包繞肌間神經(jīng)節(jié)（Myenteric ganglion）周圍的精細(xì)神經(jīng)末梢結(jié)構(gòu)，這一結(jié)構(gòu)是整個(gè)食管肌層內(nèi)唯一的迷走感覺神經(jīng)纖維，也代表了整個(gè)消化管內(nèi)主要的迷走神經(jīng)傳入結(jié)構(gòu)，具有機(jī)械感受器的作用并對(duì)ATP起反應(yīng)[7]。本研究應(yīng)用免疫熒光組織化學(xué)雙標(biāo)方法研究了P2X2受體陽性感覺末梢在小鼠食管的分布和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，以及與作為脊神經(jīng)傳入纖維標(biāo)志的降鈣素基因相關(guān)肽（Calcitonin gene-related peptide，CGRP）陽性纖維[8]的關(guān)系。此外，還觀察了P2X2受體和CGRP陽性神經(jīng)元在結(jié)狀神經(jīng)節(jié)和背根神經(jīng)節(jié)的分布。

1　材料與方法

1.1材料

雄性C57BL/6小鼠12只，0.4%戊巴比妥鈉腹腔內(nèi)注射麻醉，經(jīng)升主動(dòng)脈灌注固定。先用生理鹽水沖洗，再用Zamboni’s固定液(2%多聚甲醛和0.2%苦味酸，0.1 mol/L PB, pH7.4)灌流固定1 h，分離食管、結(jié)狀神經(jīng)節(jié)和頸、胸部背根神經(jīng)節(jié)，放入同一固定液中后固定4 h。然后浸入20%的蔗糖緩沖液(0.1 mol/L PB, pH7.4)中直至組織塊下沉。恒冷箱切片機(jī)切片，厚12 μm，裱貼于預(yù)先涂有多聚賴氨酸的玻片上，室溫下干燥1 h。

1.2免疫組織化學(xué)技術(shù)

切片用0.05 mol/L TBS（tris buffered saline，pH7.4）沖洗3次，每次10 min。再用1%牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）、0.5%Triton X-100和10%正常驢血清室溫下孵育1 h。切片用豚鼠抗P2X2受體多克隆抗體（1:500，Chemicon）及1%BSA混合液孵育，室溫過夜。為了顯示P2X2受體與CGRP的關(guān)系，同一切片中應(yīng)用了P2X2/CGRP免疫組織化學(xué)雙標(biāo)法。在濕盒內(nèi)切片分別用豚鼠抗P2X2受體多克隆抗體和羊抗CGRP多克隆抗體（1:500,Abcam）及1%BSA混合液孵育，室溫過夜。切片用與第一抗體相匹配的結(jié)合了熒光素的二抗孵育1 h；雙標(biāo)切片用結(jié)合了熒光素的二抗混合液（1:1）濕盒內(nèi)孵育，其中驢抗豚鼠IgG結(jié)合Cy3（1:400,Jackson），驢抗羊IgG結(jié)合DTAF（1:50，Jackson）。切片用TBS(pH8.6)與甘油混合液（1:1）封片。

多通道激光掃描共聚焦顯微鏡（BIO-RAD MRC2100）觀察。圖像處理應(yīng)用Adobe Photoshop (7.0) 和Corel Draw (10.0)。

對(duì)照實(shí)驗(yàn)：省去第一抗體或用P2X2多肽（100 μg/mL）吸收，其它過程與上述免疫組織化學(xué)程序相同。結(jié)果均為陰性。

2　結(jié)果

2.1P2X2陽性感覺纖維在食管的分布

在食管頸部、胸部和腹部各個(gè)水平的切片均可觀察到P2X2陽性神經(jīng)纖維末梢。這些P2X2陽性纖維集中分布在食管肌層的內(nèi)、外兩層之間，肌間神經(jīng)節(jié)所在區(qū)域，全部或部分的包繞在肌間神經(jīng)節(jié)周圍（圖1,2)。一些P2X2陽性纖維伸入到肌間神經(jīng)節(jié)內(nèi)，許多帶有樹突棘樣結(jié)構(gòu)的分支或串珠樣纖維分支相互纏繞在一起形成許多結(jié)構(gòu)復(fù)雜、形態(tài)各異的板層狀末梢結(jié)構(gòu)（圖3a），即所謂的神經(jīng)節(jié)內(nèi)板狀末梢(IGLEs)。可見P2X2陽性IGLEs所形成的不規(guī)則板層末梢結(jié)構(gòu)包繞在肌間神經(jīng)元胞體的周圍（圖1,2,3a)。肌間神經(jīng)節(jié)內(nèi)未觀察到P2X2陽性的神經(jīng)元胞體。食管的粘膜層和粘膜下層未見到P2X2陽性的神經(jīng)纖維和末梢。

2.2CGRP陽性纖維在食管的分布及與P2X2陽性纖維的關(guān)系

小鼠食管內(nèi)有大量彌散分布的CGRP陽性纖維。在黏膜層、黏膜下層和肌層均可見許多游離分布的串珠樣CGRP陽性纖維，可見到一些纖維分支伸入到肌間神經(jīng)節(jié)內(nèi)，或圍繞在肌間神經(jīng)節(jié)的周圍。免疫熒光雙標(biāo)顯示，食管內(nèi)P2X2與CGRP分別代表兩種分布和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)完全不同的神經(jīng)纖維，CGRP陽性纖維為游離分布，而P2X2陽性纖維形成IGLEs?？梢娫S多串珠樣CGRP陽性纖維伸入到肌間神經(jīng)節(jié)內(nèi)與P2X2陽性IGLEs形成密切接觸（圖3a-c），或與P2X2陽性末梢纏繞在一起，或包繞在P2X2陽性IGLEs的周圍（圖4a-c）。沒有觀察到P2X2和CGRP在同一纖維或末梢的共存。

2.3P2X2在背根神經(jīng)節(jié)和結(jié)狀神經(jīng)節(jié)的表達(dá)及與CGRP共存

背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)存在大量P2X2陽性神經(jīng)元胞體和彌散神經(jīng)纖維。P2X2陽性神經(jīng)元胞體多為中、小型神經(jīng)元，其形態(tài)為圓形、卵圓形（圖5a）。CGRP在背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)的標(biāo)記與P2X2類似，許多中、小型神經(jīng)元胞體和神經(jīng)纖維表現(xiàn)為CGRP陽性（圖5b）。免疫熒光雙標(biāo)顯示，背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)許多中、小型CGRP陽性神經(jīng)元表達(dá)P2X2（圖5c）。

P2X2在結(jié)狀神經(jīng)節(jié)的標(biāo)記與背根神經(jīng)節(jié)類似，可見許多中、小型神經(jīng)元胞體和彌散神經(jīng)纖維呈P2X2陽性（圖6a）。CGRP在結(jié)狀神經(jīng)節(jié)內(nèi)的標(biāo)記與背根神經(jīng)節(jié)不同，結(jié)狀神經(jīng)節(jié)內(nèi)CGRP陽性神經(jīng)元胞體非常稀少（圖6b），可見少量CGRP陽性神經(jīng)纖維。P2X2與CGRP熒光雙標(biāo)結(jié)果與背根神經(jīng)節(jié)結(jié)果也明顯不同，沒有見到P2X2/CGRP雙標(biāo)神經(jīng)元胞體（圖6c）。

3　討論

本文結(jié)果證明了在小鼠食管肌間神經(jīng)節(jié)內(nèi)有豐富的P2X2陽性感覺末梢，并形成IGLEs樣結(jié)構(gòu)。食管內(nèi)的感覺纖維有兩類，一部分為來自結(jié)狀神經(jīng)節(jié)的迷走神經(jīng)感覺纖維，另一部分為來自背根神經(jīng)節(jié)的脊神經(jīng)感覺纖維。消化管內(nèi)IGLEs已經(jīng)被實(shí)驗(yàn)性迷走神經(jīng)切斷術(shù)和迷走結(jié)狀神經(jīng)節(jié)順行性追蹤方法證實(shí)為迷走神經(jīng)傳入纖維[6]。順行標(biāo)記結(jié)合免疫細(xì)胞化學(xué)等方法發(fā)現(xiàn)豚鼠食管內(nèi)順行標(biāo)記的IGLEs是迷走傳入纖維，而食管內(nèi)CGRP陽性纖維則是脊神經(jīng)來源的感覺纖維，二者始終是分離的[8]，因而CGRP被認(rèn)為是脊神經(jīng)傳入纖維的標(biāo)志。本文結(jié)果顯示食管內(nèi)P2X2陽性纖維未見與CGRP共存，根據(jù)結(jié)狀神經(jīng)節(jié)內(nèi)P2X2陽性神經(jīng)元較多，CGRP陽性細(xì)胞和P2X2/CGRP雙標(biāo)細(xì)胞稀少，脊神經(jīng)節(jié)內(nèi)CGRP陽性神經(jīng)元較多，部分與P2X2共存的特點(diǎn)，也說明食管內(nèi)CGRP陽性纖維來源于脊髓，而P2X2陽性的纖維末梢可能來源于迷走神經(jīng)。根據(jù)以往研究結(jié)合本文結(jié)果，我們推測(cè)食管內(nèi)P2X2陽性纖維可能是迷走神經(jīng)來源的感覺纖維。食管內(nèi)許多CGRP陽性纖維與P2X2陽性的IGLEs相互纏繞在一起，提示來自脊神經(jīng)和迷走神經(jīng)的感覺纖維在食管內(nèi)可能存在著相互影響。

順性追蹤技術(shù)結(jié)合細(xì)胞內(nèi)電位記錄技術(shù)證實(shí)IGLEs與食管內(nèi)張力感受器在形態(tài)學(xué)上密切相關(guān)，具有機(jī)械感受器的作用[7]，這一發(fā)現(xiàn)和許多以形態(tài)學(xué)為背景的研究結(jié)果一致，也符合IGLEs化學(xué)特征[6]。有證據(jù)顯示，食管和胃內(nèi)迷走感覺神經(jīng)末梢IGLEs可被ATP興奮[7]，說明IGLEs存在ATP受體，也表明ATP是食管內(nèi)機(jī)械感受器的激動(dòng)劑，與本文的結(jié)果一致。此外，在許多內(nèi)臟器官，如小支氣管、膀胱壁等部位，也發(fā)現(xiàn)感覺神經(jīng)末梢有P2X2表達(dá)且參與機(jī)械和化學(xué)感受器興奮誘發(fā)的痛覺信號(hào)的傳到[9,10]。研究發(fā)現(xiàn)，氣管和肺內(nèi)的迷走感覺纖維也形成復(fù)雜的末梢結(jié)構(gòu)且表達(dá)P2X2[11]，與本文的結(jié)果類似。綜合以往的研究和本文結(jié)果，說明小鼠食管內(nèi)有豐富的P2X2受體陽性IGLEs，這種IGLEs可能是一種對(duì)ATP敏感、具有機(jī)械感受器作用的迷走感覺神經(jīng)末稍，ATP可能作用于P2X2參與食管內(nèi)機(jī)械和化學(xué)刺激誘發(fā)的傷害性刺激的調(diào)節(jié)。

參考文獻(xiàn)

[1] North RA. Molecular physiology of P2X receptors [J]. Physiol Rev, 2002, 82(4):1013-1067

[2] Chen Y, Zhang L, Yang J, et al. LPS-induced dental pulp inflammation increases expression of ionotropic purinergic receptors in rat trigeminal ganglion[J]. Neuroreport, 2014;25(13):991-997

[3] Brederson JD, Jarvis MF. Homomeric and heteromeric P2X3 receptors in peripheral sensory neurons [J]. Curr Opin Investig Drugs, 2008,9(7):716-725

[4] Shieh KR, Yang SC, Tseng HL, et al. Evidence for up-regulation of purinergic receptor genes associating with TRPV1 receptors and neurotrophic factors in the inflamed human esophagus[J]. Curr Mol Med, 2014;14(9):1205-1214

[5] Chen X, Gebhart GF. Differential purinergic signaling in bladder sensory neurons of naive and bladder-inflamed mice [J]. Pain, 2010,148(3):462-472

[6] Neuhuber WL, Raab M, Berthoud HR, et al. Innervation of the mammalian esophagus [J]. Adv Anat Embryol Cell Biol, 2006,185(1):1-73

[7] Zagorodnyuk VP, Brookes SJ, Spencer NJ. Structure-function relationship of sensory endings in the gut and bladder [J]. Auton Neurosci, 2010, 153(1-2):3-11

[8] Hummel T, Barz S, Holscher T. Differences in responses to nociceptive stimulation of the oral and aboral esophagus [J]. J Clini Neurosci, 2003,10(2):223–225

[9] Nassenstein C, Taylor-Clark TE, Myers AC, et al. Phenotypic distinctions between neural crest and placodal derived vagal C-fibres in mouse lungs [J]. Physiol, 2010, 588(Pt 23):4769-4783

[10] Chen X, Gebhart GF. Differential purinergic signaling in bladder sensory neurons of na?ve and bladder-inflamed mice [J]. Pain, 2010,148(3):462-472

[11] Oztay F, Brouns I, Pintelon I, et al. Neurotrophin-4 dependency of intraepithelial vagal sensory nerve terminals that selectively contact pulmonary NEBs in mice [J]. Histol Histopathol, 2010,25(8):975-984

圖板說明

The Distribution of P2X2Immunoreactive Afferent Nerve Endings in the Mouse Esophagus

PANG Chuan-wu1,2,AN Shu-hong1, WANG Zhao-jin1*

1. Department of Anatomy, Taishan Medical University, Tai’an 271000, China
2. Taishan Vocational College of Nursing, Tai’an 271000, China

Abstract:The distribution of P2X2immunoreactive afferent endings and the relationship with calcitonin gene-related peptide (CGRP) immunoreactive fibers in the mouse esophagus was studied using double immunofluorescence method combined confocal laser scanning microscope technique. P2X2immunoreactive endings were seen in sections from all levels of the mouse esophagus. The distribution of P2X2immunoreactive structures concentrated in the area between outer and inner muscular layers, covered myenteric ganglia totally or partly. The dense clusters of fine varicose P2X2immunoreactive terminals protruded into myenteric ganglia forming complexes of profuse laminar structures for intraganglionic laminar endings (IGLEs). Double immunofluorescence for P2X2and CGRP revealed that numerous varicose fibers immunoreactive for CGRP closely surrounded P2X2immunopositive IGLEs. However, P2X2immunoreactive terminals never expressed CGRP immunoreactivity. In nodose ganglion, numerous neuronal cell bodies in small- and middle-sized displayed P2X2immunoreactivity. P2X2/CGRP double-labeling neurons were rare. However, many P2X2positive neurons in dorsal root ganglion contained CGRP immunoreactivity. These results demonstrated that some afferent endings in mouse esophagus expressed nociceptor P2X2, and formed IGLEs structures.

Keywords:P2X2receptor; intraganglionic laminar endings; calcitonin gene-related peptide; esophagus; mouse

*通訊作者:Author for correspondence. E-mail:zjwang@tsmc.edu.cn

作者簡(jiǎn)介:龐傳武(1957-),男,副教授,主要從事人體解剖學(xué)和組織胚胎學(xué)教學(xué)與研究. E-mail:tawxpcw@126.com

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81371234);山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(ZR2013HM032);山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2011HW080)

收稿日期:2014-10-11修回日期: 2014-11-30

中圖法分類號(hào):R3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào):1000-2324(2015)04-0540-04